色氨酸对应激小鼠空间学习能力和下丘脑单胺类递质的影响

杨宝娟，朱建津，辛 琳，胡少明

（江南大学食品学院食品营养与安全研究所，江苏无锡214122）

色氨酸对应激小鼠空间学习能力和下丘脑单胺类递质的影响

杨宝娟，朱建津*，辛 琳，胡少明

（江南大学食品学院食品营养与安全研究所，江苏无锡214122）

目的：研究色氨酸对慢性应激抑郁模型小鼠空间学习记忆、下丘脑单胺类神经递质（5-HT，NE）及糖水偏爱度的影响。方法：应用慢性不可预见性刺激结合孤养4周的方法建立慢性应激抑郁小鼠模型，小鼠随机分为空白对照组（NC）、应激抑郁模型组（CUS）、应激抑郁模型+低剂量色氨酸（CUS-L）组、应激抑郁模型+高剂量色氨酸（CUS-H）组。水迷宫实验测定小鼠空间学习记忆的能力，称取胸腺和脾脏测定胸腺和脾脏指数，ELISA法检测下丘脑5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）的含量。结果：与对照组相比，模型组小鼠下丘脑中5-HT水平降低，NE含量升高；对糖水的偏爱度下降；胸腺、脾脏指数降低；与模型组相比，实验组5-HT水平升高，NE含量降低；对糖水的偏爱度增加；胸腺、脾脏指数升高。结论：色氨酸可提高应激抑郁模型小鼠空间学习记忆能力，增加其对糖水的偏爱性，同时使下丘脑中5-HT含量增加，NE含量减少，脏器指数的变化提示色氨酸有抗应激作用，并对机体免疫起调节作用。

色氨酸，应激抑郁，空间学习记忆，单胺类神经递质

随着社会经济不断发展，生活节奏不断加快，竞争日趋激烈，工作、学习和生活等各个方面压力也不断增加，加之外界环境的恶化使得人们处于应激的机会越来越多。机体在应激状态下[1]，主要通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统（HPA）和交感-肾上腺髓质系统（SAM）分泌的应激激素来调节并完成对应激的适应。当应激持续时间过长或过于强烈而超出机体自身调节范围时，可能会引起学习和记忆障碍、抑郁、应激性精神紊乱、免疫系统功能紊乱等。实验研究[2-3]表明，应激能够影响人体和动物的免疫功能。临床显示[4-5]，机体免疫功能的紊乱可直接导致感染性疾病、肿瘤等的发生或者进一步的恶化。色氨酸是5-HT生物合成的前体物质，5-HT具有调控机体情绪的作用，膳食中色氨酸水平可以调节机体内5-HT的含量[6]，但色氨酸对应激致抑郁小鼠的行为，NE水平及免疫功能有何影响并不明确。因此本实验采用慢性应激结合孤养的方法，建立慢性不可预见性应激致小鼠抑郁模型，通过灌胃不同剂量的色氨酸溶液，测定体内单胺类神经递质含量变化，观察小鼠空间学习记忆能力，对糖水的偏爱性等，探讨色氨酸不同摄入量对应激致抑郁小鼠行为、神经递质及免疫功能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6周龄清洁级健康雄性昆明种小鼠60只，体重18~ 20g 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005；动物饲料 标准饲料，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；L-色氨酸 上海康达氨基酸厂；小鼠下丘脑5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）酶联免疫检测试剂盒 购自美国R&D公司。

MK3型酶标仪 上海雷勃分析仪器厂；低温高速离心机 上海安亭科学仪器厂；W201B型恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 60只小鼠预饲4d后按照体重随机分为4组，每组15只：空白对照组（NC组）、慢性不可预见性应激抑郁模型组（CUS组）、慢性不可预见性应激+低剂量色氨酸组（CUS-L组）、慢性不可预见性应激+高剂量色氨酸组（CUS-H组）。

1.2.2 慢性不可预见性应激[7]抑郁动物模型 用慢性不可预见性刺激结合孤养建立应激抑郁模型。造模方法：将禁水（24h）、禁食（24h）、4℃冰水游泳（5min）、成组饲养（24h）、潮湿笼子（12h）、45°倾斜笼子（12h）、摇晃（5min）7种应激原随机安排于一周内，每天给予1种应激原刺激，连续4周且同种应激不能连续出现。除NC组外，其余各组均1只/笼，孤养。

1.2.3 给药方法和剂量 除空白组外其余3组每周内每天接受一种应激原，不重复，连续28d同时每日给予灌胃处理，正常组与模型组灌胃相应体积的生理盐水；CUS-L组按100mg/kg·bw的剂量灌胃色氨酸溶液；CUS-H组按200mg/kg·bw的剂量灌胃色氨酸溶液。

1.3 水迷宫-空间学习记忆实验

水迷宫由一圆形水池和一可移动位置的站台组成，水池上空通过数字摄像头与计算机连接。预先在水池中注入清水，加入碳素墨水使池水变为不透明黑色，水面高出站台表面0.5cm，水温控制在（27±1）℃。

空间学习记忆测试 第1~4d进行定位航行实验，第5d撤去平台进行空间搜索实验，将小鼠从同一入水点放入水池，测其第一次到达原平台的时间及穿越原平台的次数。

1.4 糖水偏爱实验[8]

实验前48h，给小鼠双瓶饮水，一瓶为1%的蔗糖溶液，另一瓶为普通饮用水。然后禁水禁食20h后，再次给予小鼠双瓶饮水，1h后，通过称量饮水瓶的重量计算小鼠蔗糖溶液及饮用水的消耗量

小鼠对糖水的偏爱性（%）=糖水摄入（g）/总摄入量（g）

1.5 下丘脑匀浆上清液制备

实验结束，将禁食12h的小鼠处死后迅速断头取脑，于冰袋分离下丘脑并称重，用0.90%预冷的生理盐水做匀浆介质制得10%的组织匀浆（w∶v），于低温冷冻10000r/min离心15min，取上清，-20℃保存，用于检测下丘脑中5-HT、NE含量。

1.6 下丘脑中5-HT、NE含量测定

下丘脑中5-HT、NE含量按照美国R&D公司试剂盒说明书进行测定，单位用每克湿重组织中含量表示（ng/g）。

1.7 实验数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 色氨酸对应激抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响

表1 色氨酸对小鼠定位航行实验逃避潜伏期的影响（±s，n=15）Table 1 Effect of tryptophan on escape incubation period of orientation navigation experiments in depressed model mice（±s，n=15）

表1 色氨酸对小鼠定位航行实验逃避潜伏期的影响（±s，n=15）Table 1 Effect of tryptophan on escape incubation period of orientation navigation experiments in depressed model mice（±s，n=15）

注：同列数据不同字母表示显著差异（p<0.05），表2~表5同。

组别 第1天 第2天 第3天 第4天NC 22.48±6.12b18.69±2.67c17.44±3.49c16.34±5.68b CUS 42.39±8.29a37.41±2.44a33.31±3.20a26.60±3.38a CUS-L 32.30±7.07b26.18±3.92b22.17±3.39b21.60±4.22b CUS-H 30.75±7.31b21.72±2.47c19.38±3.61bc19.23±4.29b

表2 色氨酸对小鼠空间搜索实验学习记忆的影响（±s，n=15）Table 2 Effect of tryptophan on learning and memory capacity of space search experiment in depressed model mice（±s，n=15）

表2 色氨酸对小鼠空间搜索实验学习记忆的影响（±s，n=15）Table 2 Effect of tryptophan on learning and memory capacity of space search experiment in depressed model mice（±s，n=15）

组别 给药剂量 首次到原平台时间（s）穿越原平台次数NC 生理盐水 16.01±3.09c 5.45±2.01a CUS 生理盐水 25.21±3.31a 2.67±1.22b CUS-L 100mg/kg·bw 20.11±2.93b 4.89±1.05a CUS-H 200mg/kg·bw 18.97±2.19bc 5.22±1.09a

由表1、表2可知，与NC组相比，定位航行实验中CUS组小鼠的逃避潜伏期显著延长（P<0.05），空间搜索实验中CUS组小鼠穿越原平台次数明显减少（P<0.05），说明慢性不可预见性应激致抑郁小鼠的学习记忆能力下降。与CUS组比较，CUS-L、CUS-H组小鼠的逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），穿越原平台次数明显增加（P<0.05）。对水迷宫实验结果分析可知，色氨酸对慢性不可预见性应激抑郁模型小鼠学习记忆障碍有一定改善作用，且CUS-H组对CUS组小鼠空间学习记忆能力的提高大于CUS-L组。

2.2 色氨酸对应激抑郁模型小鼠下丘脑中5-HT、NE含量变化的影响

表3表明，CUS组小鼠下丘脑中5-HT含量比NC组显著降低（P<0.05），而NE含量比NC组升高（P<0.05），表明应激致抑郁小鼠下丘脑内单胺类神经递质含量发生变化。与CUS组比，色氨酸组下丘脑中5-HT含量有一定程度的升高（P<0.05），同时下丘脑中NE含量降低（P<0.05）。在模型组水平上，实验组对下丘脑内单胺类神经递质含量的调节作用CUS-H组效果比CUS-L显著。

表3 色氨酸对小鼠下丘脑5-HT、NE含量的影响（±s，n=15）Table 3 Effect of tryptophan on levels of 5-HT and NE monoamine neural transmitter of hypothalamus in depressed model mice（±s，n=15）

表3 色氨酸对小鼠下丘脑5-HT、NE含量的影响（±s，n=15）Table 3 Effect of tryptophan on levels of 5-HT and NE monoamine neural transmitter of hypothalamus in depressed model mice（±s，n=15）

组别 给药剂量 5-HT（ng/g湿组织）NE（ng/g湿组织）NC 生理盐水 138.55±5.98a 46.49±199c CUS 生理盐水 113.84±4.20d 58.67±2.48a CUS-L 100mg/kg·bw 122.89±3.22c 51.17±2.45b CUS-H 200mg/kg·bw 130.87±3.01b 49.35±2.13bc

2.3 色氨酸对应激抑郁模型小鼠糖水偏爱性及脏器指数的影响

表4 色氨酸对小鼠糖水偏爱程度的影响（±s，n=15）Table 4 Effect of tryptophan on sugar water preferences in depressed model mice（±s，n=15）

表4 色氨酸对小鼠糖水偏爱程度的影响（±s，n=15）Table 4 Effect of tryptophan on sugar water preferences in depressed model mice（±s，n=15）

组别 给药剂量 糖水偏爱程度（%）NC 生理盐水 53.67±1.95b CUS 生理盐水 49.90±2.88c CUS-L 100mg/kg·bw 53.87±1.57b CUS-H 200mg/kg·bw 57.14±2.36a

表5 色氨酸对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（±s，n=15）Table 5 Effect of tryptophan on the thymus and spleen index in depressed model mice（±s，n=15）

表5 色氨酸对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（±s，n=15）Table 5 Effect of tryptophan on the thymus and spleen index in depressed model mice（±s，n=15）

组别 给药剂量 胸腺指数（mg/g） 脾脏指数（mg/g）NC 生理盐水 1.22±0.04a 2.93±0.39a CUS 生理盐水 0.97±0.07c 2.23±0.18c CUS-L 100mg/kg·bw 1.09±0.05b 2.56±0.19b CUS-H 200mg/kg·bw 1.14±0.03b 2.73±0.38ab

由表4和表5知，与NC组比，CUS组小鼠糖水偏爱程度降低（P<0.05），胸腺和脾脏指数显著降低（P< 0.05），对糖水的偏爱度降低表明应激致抑郁小鼠快感降低，脏器指数下降表明应激影响小鼠的免疫系统；灌胃色氨酸后，实验组小鼠糖水偏爱程度增高，CUSL组和CUS-H组没有差异（P>0.05），胸腺、脾脏指数较CUS组均明显提高（P<0.05），但仍然低于NC组。

3 结论与讨论

应激是机体接受应激原刺激后所表现出来的一系列非特异性反应，包括行为、神经、内分泌和免疫等方面。研究表明，长期慢性应激会导致机体免疫系统处于抑制状态[9]，从而使机体免疫力降低；同时HPA轴功能亢进，交感神经兴奋分泌促肾上腺髓质激素，产生大量的去甲肾上腺素。若应激持续存在则HPA轴继续亢进，机体相应会出现抑郁症状[10]，如情绪低落、学习和记忆能力下降、快感缺乏、思维迟缓、运动迟滞、食欲降低、睡眠减少等。

本研究发现，与NC组比较，CUS组小鼠空间学习记忆能力出现障碍；下丘脑中5-HT含量显著下降，而NE含量上升；同时，CUS组对糖水的偏爱性降低，小鼠胸腺和脾脏指数显著降低。灌胃一定剂量的色氨酸后，小鼠学习记忆障碍在一定程度上得到改善，下丘脑中5-HT含量升高，NE含量降低；对糖水偏爱程度也有一定的增加，胸腺指数和脾脏指数的升高说明色氨酸对应激致抑郁小鼠的免疫机能有调节作用。有研究[11]指出，大鼠暴露于噪声应激下，其学习和记忆能力会受到明显的影响；Nacher等[12]认为，抑郁患者出现认知、情感等方面症状可能是因为与学习有关的海马体积萎缩造成。本研究中水迷宫实验证实应激致抑郁小鼠学习记忆能力下降，糖水实验发现应激致抑郁小鼠对糖水偏爱百分比下降，提示小鼠出现快感消失。本实验中应激致抑郁小鼠下丘脑中NE含量升高，与本实验不同，畅洪昇等[13]对抑郁模型大鼠的研究发现，抑郁大鼠脑内NE含量显著下降。临床实验显示[9]，免疫系统与中枢神经系统有双向调节的作用，免疫系统的变化也可引起人和动物情绪与行为的改变，而情绪障碍会影响免疫系统。

慢性长期应激可致抑郁，细胞因子学说[14]认为，抑郁病患者尤其是重症抑郁患者，血中促炎症因子浓度增高，且许多以慢性炎症反应为特征的疾病多伴有抑郁症状；早期研究[15]发现应激引起HPA轴功能失调，患者体内血浆糖皮质激素增高，另外HPA轴功能的持续亢进可导致海马释放过多的谷氨酸，使海马神经元受损，而受损海马对HPA轴负反馈作用降低，进一步加重HPA轴功能障碍，二者形成恶性循环导致抑郁发生。本实验中应激致抑郁小鼠出现学习记忆损伤，单胺类神经递质失衡及糖水偏爱性下降等变化，进一步说明应激会对机体产生多方面的影响。

连续灌胃色氨酸4周能显著改善应激致抑郁小鼠的空间学习记忆障碍，有效调控下丘脑中单胺类神经递质的变化，还可提高应激小鼠对糖水的偏爱性，脏器指数的变化表明色氨酸对抑郁小鼠的免疫机能具有一定的调节作用。本实验中色氨酸所表现出的抗抑郁功能，为其临床应用及抑郁症的预防和相关治疗提供了一定的理论参考依据。鉴于抑郁症病因及治疗机制复杂，色氨酸具体以何种机制影响抑郁模型小鼠学习记忆功能、调节免疫机能以及抑郁模型小鼠体内NE含量如何变化，还有待于进一步研究。

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Effect of tryptophan on spatial learning ability and hypothalamus monoamine neural transmitter of depression model mice

YANG Bao-juan，ZHU Jian-jin*，XIN Lin，HU Shao-ming
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Objective：Experiments were conducted to investigate the effect of tryptophan on spatial learning and memory ability，monoamine neural transmitter level（5-HT，NE）in hypothalamus and sugar water preferences of depression model mice.Methods：Stress depression model was established by the application of Chronic Unpredictable Stress（CUS）and solitary raised for 4 weeks.60 mice were divided randomly into 4 groups：the normal control（NC）group，chronic unpredictable stress（CUS）group，chronic unpredictable stress with lowdose tryptophan（CUS-L）group，chronic unpredictable stress with high-dose tryptophan（CUS-H）group. Morris water maze was used to assess spatial learning and memory ability，then weighed organs and calculate organs/body weight ratio，content of 5-HT and NE in hypothalamus were detected by ELISA method.Results：Compared with NC group，5-HT level，sugar water preferences and organs/body weight ratio significantly reduced while NE level was increased in CUS group；in both CUS-L and CUS-H groups，after irrigation stomach tryptophan for 28d，not only 5-HT level，sugar water preferences but also organs/body weight ratio were significantly increased，however，NE concentration was declined.Conclusion：For depressed model mice，tryptophan could enhance mice spatial learning and memory ability，increase its preference for sugar water，improve 5-HT level but reduce NE level in hypothalamus，and changes of visceral index meant that tryptophan had the role of anti-stress as well as immune regulation.

tryptophan；stress depression；spatial learning and memory；monoamine neural transmitter

TS201.4

A

1002-0306（2012）07-0379-04

2011－06－20 *通讯联系人

杨宝娟（1985-），女，在读硕士，研究方向：营养与食品卫生学。

十二五国家科技支撑计划课题（2012BAD33B05）。