五味子药材中苹果酸、柠檬酸的测定方法研究

张 韵， 傅 颖， 吴霞红

（1.上海市中药质量监督检验室，上海 200336；2.上海体育科学研究所，上海 200030）

五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果实，其功效收敛固涩、益气生津、补肾宁心［1］，兼有药用与营养作用两种属性。近年来，对五味子的研究表明，其具有增强免疫、提高抗氧化机能以及改善肠道菌群等作用［2-3］。五味子中有机酸含有量的高低代表着药材的成熟度，与五味子的有机酸如苹果酸、柠檬酸具有一定的关联，本实验以研究有机酸为目的，开发新产品，为保证产品质量，把好原药材质量关，有必要建立五味子中苹果酸、柠檬酸的高效液相检测方法。

1 仪器、试药与样品

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪；G1322A自动进样器；G1316A柱温箱；DAD G1315B检测器；超声波清洗机SK7200LH，功率350 W，59 kHZ，上海科导超声仪有限公司。

1.2 试药、试剂 柠檬酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号111679-200401，供定量测定用)；L-苹果酸对照品SIGMA公司，批号 01011AE，供定量测定用)；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。五味子药材产自辽宁，6个批次(批号见样品检验结果)均按照2010版中国人民共和国药典一部检验结果符合规定。

2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按2010年版中国药典一部梯度洗脱方法(按表1进行梯度洗脱)，检测波长为209 nm；柱温15℃；进样量10 μL；色谱柱理论塔板数按苹果酸、柠檬酸色谱峰计算应不低于3000。

表1 苹果酸、柠檬酸梯度洗脱顺序

3 方法与结果

3.1 对照品溶液的制备

苹果酸对照品溶液的制备 精密称取苹果酸对照品11.62 mg，置25 mL量瓶中，加0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。制成0.4648 mg/mL的对照品溶液，备用。

柠檬酸对照品溶液的制备 精密称取柠檬酸对照品21.22 mg置25 mL量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.849 mg/mL的对照品溶液，备用。

3.2 供试品溶液的制备 取五味子药材适量粉碎，使其全部通过60目筛。精密称取粉末约0.5 g置25 mL量瓶中，加水适量超声60 min，冷却至室温，定容，滤过，取滤液15 mL，减压浓缩至干，用0.1%H3PO4溶液溶解并定量转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。经0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

3.3 色谱条件及系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；检测波长为209 nm；苹果酸、柠檬酸的测定均按表1进行梯度洗脱，苹果酸测定的柱温为15℃；柠檬酸测定的柱温为23℃；以苹果酸、柠檬酸色谱峰计，理论塔板数应不低于3000。

3.3.1 检测波长的选择 取苹果酸和柠檬酸对照品的水溶液，高效液相色谱仪分别进样，考察苹果酸和柠檬酸在190～380 nm波长范围内的光谱吸收图，苹果酸和柠檬酸在209 nm处有稳定的、较大的吸收峰，故选择209 nm作为苹果酸和柠檬酸HPLC检测波长。

3.3.2 供试品提取方法的选择

取0.5061 g药材粉末，置25 mL量瓶中，加水适量超声1 h，冷却至室温并稀释至刻度，取滤液15 mL，按3.2项供试品制备项制备，在上述苹果酸和柠檬酸色谱条件下，分别注样分析。结果见表2。

取0.5216 g药材粉末，精密加入25 mL水，回流1 h，冷却至室温并稀释至刻度，取滤液15 mL，按供试品制备项制备，在上述苹果酸和柠檬酸色谱条件下色谱条件下，分别注样分析。结果见表2。结果表明，采用超声提取法提取比较完全，且方法操作简单。

表2 药材中苹果酸和柠檬酸测定的提取方法比较

3.3.3 苹果酸和柠檬酸线性关系考察 分别吸取苹果酸和柠檬酸对照品备用液，在上述苹果酸和柠檬酸色谱条件下，苹果酸进样 1、3、5、8、10、15、20 μL，柠檬酸进样 2、5、8、10、12、15、18 μL，各浓度进样 2 次，取峰面积的平均值。以峰面积为纵坐标，苹果酸、柠檬酸进样量为横坐标，分别绘制成标准曲线，计算得回归方程:苹果酸Y=66.32X+1.49，柠檬酸Y=87.66X+0.29，相关系数分别为0.9996和0.9999。结果表明，苹果酸、柠檬酸在0.4648～9.296 μg和1.698～15.282 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.3.4 精密度考察 精密吸取上述苹果酸和柠檬酸供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样7次，平均峰面积分别为318.0605，RSD为1.63%和744.1637，RSD为1.49%，结果表明精密度良好。

3.3.5 稳定性试验 取药材五味子按供试品溶液制备项制备，在上述色谱条件下，每隔1 h测定一次，连续进样10次，考察供试品溶液的稳定性。结果表明供试品溶液在10 h内测定结果稳定，苹果酸平均峰面积165.4521，RSD为2.0%(n=10)；柠檬酸平均峰面积888.0191，RSD为1.41%(n=10)。

3.3.6 重复性试验 精密称取同一批号J070805的五味子药材样品5份，按供试品溶液制备项制备，在上述色谱条件下，按定量测定方法进行测定，测得苹果酸和柠檬酸平均质量分数分别为0.918%(RSD1.98%)和8.502%(RSD1.98%)。结果表明本法重复性良好。

3.3.7 加样回收率试验 取已测定的同一批号J070805的五味子药材样品6份(该批样品平均含苹果酸量为1.05%，柠檬酸为8.56%)，分别精密加入苹果酸和柠檬酸对照品溶液，按供试品溶液制备项方法处理，在上述色谱条件下，按定量测定方法测定苹果酸和柠檬酸，计算回收率，结果见表3、4。结果表明回收率良好。

表3 苹果酸加样回收率试验结果 ()

表3 苹果酸加样回收率试验结果 ()

取样量/g已知量/mg加入量/mg实测量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.2428 2.549 1.698 4.170 95.460.2375 2.494 4.153 97.700.2402 2.522 2.264 4.692 95.85 95.98 1.010.2383 2.502 4.686 96.470.2155 2.263 2.83 4.954 95.090.2207 2.317 5.015 95.33

表4 柠檬酸加样回收率试验结果

3.4 6批五味子药材样品的定量测定 取6批五味子药材按供试品溶液制备项下操作，每批分别制成3份供试品溶液。在上述色谱条件下，分别注样分析，以外标法计算。结果见表5。见图1～2。

表5 6批药材定量测定结果

图1 苹果酸对照品(A)及五味子药材中苹果酸(B)HPLC图谱

图2 柠檬酸对照品(A)及五味子药材中柠檬酸(A)HPLC图谱

4 小结与讨论

4.1 在样品提取处理方面曾采取不同时间的比较试验，实验结果表明现采取超声波提取优于回流提取60 min已完全能提取有机酸成分。

4.2 由于苹果酸和柠檬酸吸收波长，化学性质相近，故而本实验采用梯度洗脱和适当调节柱温的差异，得到成功分离。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:61.

［2］李建平，单安山，程宝晶，等.五味子、柠檬酸对断奶仔猪血清生化指标和免疫功能的影响［J］.中国畜牧杂志，2009，45(17):25-29.

［3］Hancke J L，Burgos R A，Ahumada F.Schisandra chinensis(Turcz.)Baill［J］.Fitoterapia，1999，70(5):451-471.

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［5］唐慧慧，蔡清宇，毛 翼.HPLC法测定净乌梅及乌梅炭中柠檬酸和苹果酸的含量［J］.中药材，2007，30(1):52-54

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