实现人源FGF－21高效可溶性表达的两种策略

李 娟， 刘 雯， 肖 磊， 劳 勋， 赵丽芬， 黄 静， 吴自荣

（华东师范大学 生命科学学院，上海 200062）

0 引 言

成纤维生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF－21）是FGF家族新成员，属于FGF19亚族，与FGF19同源性达35%，主要存在于哺乳动物的肝组织、骨骼肌组织以及胸腺组织中［1，2］.FGF－21的重要生理功能包括调节脂肪组织对葡萄糖的摄取，调节机体血糖［3］，提高胰腺β细胞的存活率，改善β细胞的功能［4］，抵制肥胖，加速能量消耗［5］，而且尚未发现产生低血糖、体重增加等［5］副作用，因此在2型糖尿病治疗中有良好的应用前景.

根据国外 Kharitonenkov［3］和国内姜媛媛［6］等人的文献报道，人源FGF－21在大肠杆菌中可溶性差，常以包涵体表达，为后续研究带来不便.分子伴侣能够帮助蛋白质正确折叠，提高蛋白的可溶性.沈继红等［7］使用4种分子伴侣蛋白实现低温脂肪酶Lip－837可溶性表达，Arayo Haga等［8］利用分子伴侣质粒pTf16表达了可溶性人源自分泌运动因子Autotaxin.本文采用引入分子伴侣Tig协助蛋白折叠的方法以期实现FGF－21高效可溶性表达.

在pET表达系统中，通常采用非代谢性乳糖类似物异丙基－β－D－巯基半乳糖苷（IPTG）作为诱导物进行诱导.IPTG虽能够诱导蛋白表达，但其本身对于细胞有一定的毒害作用，影响细菌的正常生长［9］.20世纪80年代Coffey等［10，11］利用自诱导方法在人角化细胞中获得了大量TGF－α蛋白.美国布鲁克黑文国家实验室的Studier［12］和他的小组成员们不断地摸索探究，总结出自诱导培养基配方，并且在如Ding Y［13］高效表达TAP碱性磷酸酶、顾娟［9］表达的胰高血糖素样肽－1突变体（mGLP－1）等实验中得到证实.自诱导发酵的最终菌体密度大，蛋白产量高，但目前该系统的应用研究较少.本研究拟考察在大肠杆菌中自诱导表达FGF－21融合蛋白的可行性，以提高蛋白产量.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）和质粒pET32a（＋）均为本实验室保藏.

质粒pDONR223－FGF－21购于上海英基生物科技有限公司.质粒pTf16由上海生物制品研究所提供.

1.1.2 主要试剂及仪器

工具酶，Takara公司；BCA蛋白质定量测定试剂盒，上海博彩生物科技有限公司；Mini－ProteinII型聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳槽（Bio－rad公司）；血糖测试仪，上海新立医疗器械有限公司.

1.1.3 乳糖自诱导培养基

胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.5%，甘油0.5%，葡萄糖0.05%，乳糖0.2%，Na2HPO450 mmol／L，KH2PO450 mmol／L，（NH4）2SO425 mmol／L，MgSO42 mmol／L.

1.1.4 实验动物

清洁级雄性健康C57BL／6小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2007－0005.

1.2 方法

1.2.1 重组载体pET32a（＋）－FGF－21的构建

利用Clone Manager生物软件，根据FGF－21 cDNA序列设计上游引物P1和下游引物P2.上下游引物的5′端分别引入酶切位点BglⅡ和EcoRⅠ.引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如下：

P1 5′－GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC－3′，BglⅡ；

P2 5′－ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG－3′，EcoRⅠ.

以质粒pDONR223－FGF－21为模板，利用上述引物进行PCR反应.将PCR产物和质粒pET32a（＋）用限制性内切酶BglⅡ／EcoRⅠ酶切，分别回收大片段进行连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中.提取重组质粒，用BglⅡ／EcoRⅠ双酶切鉴定和菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的克隆进行DNA测序.

1.2.2 FGF－21融合蛋白的自诱导表达及分离纯化

将含有分子伴侣Tig基因的质粒pTf16和测序正确的重组质粒pET32a（＋）－FGF－21分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中.挑取转化后的单菌落接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、210 r／min培养12 h.将培养12 h的菌液按1%的比例转接入乳糖自诱导培养基中，27℃、210 r／min培养16 h，离心收集菌体.

取少量菌液进行菌密度检测，同时收集菌体进行超声破碎，分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE电泳.目的蛋白在上清中表明融合蛋白为可溶性表达，若在沉淀中表明其为包涵体.

剩余菌体重悬于IDA0（20 mmol／L Tris－HCl pH7.4，0.5 mol／L NaCl）中，超声破碎并收集上清.上清经镍离子亲和层析柱纯化，收集各洗脱组分，用SDS－PAGE检测融合蛋白所在组分，将对应洗脱液超滤浓缩并脱盐，得到融合蛋白.

1.2.3 凝胶成像分析

通过天能凝胶成像系统获得凝胶图谱，用软件ImageJ对凝胶图谱上的蛋白条带进行光密度扫描半定量分析，计算融合蛋白总表达量和可溶性融合蛋白的比例.融合蛋白总表达量通过计算融合蛋白TrxA－FGF－21占全菌总蛋白的百分比而得，可溶性融合蛋白的比例＝上清中融合蛋白TrxA－FGF－21／（上清融合蛋白 TrxA－FGF－21＋沉淀融合蛋白 TrxA－FGF－21）×100%.总可溶性蛋白相对产量＝表达量（%）×可溶性（%）×菌体密度OD600.

1.2.4 FGF－21蛋白的纯化

肠激酶酶解TrxA－FGF－21融合蛋白，30℃裂解10～16 h，终止反应，再次进行镍离子亲和层析，收集含FGF－21的组分，用截留分子量为10 kD的Millipore Amicon Ultra－15超滤管将蛋白脱盐并浓缩，得到重组蛋白FGF－21.BCA法测定蛋白含量.

1.2.5 FGF－21的降血糖活性检测

雄性健康C57BL／6小鼠分为2组（n＝6）.A组为生理盐水对照组；B组为给药组.

连续注射7 d FGF－21，于第7天进行小鼠口服糖耐量（OGTT）实验.糖耐量实验是在小鼠禁食16 h后，于第7天早上测基础血糖，然后按0.5 mg／kg皮下注射FGF－21，对照组注射0.9%NaCl溶液.1 h后，对小鼠（4 g／kg）进行口服50%葡萄糖，此时计为0时刻，再分别于第15、30、45、60、75、90和105 min进行小鼠尾静脉取血，测定血糖浓度，以检测FGF－21的降血糖活性.

1.2.6 FGF－21对脂代谢的影响

雄性健康C57BL／6小鼠分为2组（n＝6）.A组为生理盐水对照组；B组为给药组.

连续注射28 d FGF－21，于第29天对小鼠眼球采血，血样4℃放置30～60 min后，4 000r／min离心10 min，取血清，委托德赛诊断系统（上海）有限公司测定血清中甘油三酯水平.

1.2.7 统计学分析

实验所得数据以平均数±标准差表示（X±SD），并用t检验统计组间差异，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著.

2 结果与分析

2.1 FGF－21表达载体的构建与序列分析

重组质粒pET32a（＋）－FGF－21进行BglⅡ／EcoRⅠ双酶切和PCR鉴定，双酶切后大、小片段位置与理论值相符.PCR鉴定所得目的片段约578 bp，与FGF－21基因片段大小一致（见图1）.将该阳性克隆委托上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果正确.

图1 重组质粒pET32a（＋）－FGF－21的双酶切鉴定和PCR鉴定Fig.1 Identification of recombinant pET32a（＋）－FGF－21 plasmid by BglⅡ／EcoRⅠdouble enzymy digestion and PCR

2.2 融合蛋白TrxA－FGF－21的诱导表达

基因工程菌株pET32a（＋）－FGF－21／BL21（DE3）经0.1 mmol／L IPTG诱导，融合蛋白表达量为15.6%，可溶性仅为34.7%（见图2）.0.1 mmol／L IPTG诱导16 h，OD600达到1.84，融合蛋白 TrxA－FGF－21表达量为17.5%，可溶性达到92.4%.在分子伴侣协同表达下，TrxA－FGF－21融合蛋白的可溶性大大提高（见图3）.

图2 pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的IPTG诱导表达Fig.2 Expression of pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by IPTG induction

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图3 pTf16和pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的IPTG诱导表达Fig.3 Expressions of pTf16 and pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by IPTG induction

利用乳糖自诱导培养基诱导表达菌株pET32a（＋）－FGF－21／pTf16／BL21（DE3），并对表达的蛋白进行可溶性鉴定（见图4）.结果显示经乳糖自诱导培养基诱导培养16 h后，TrxA－FGF－21融合蛋白表达量占菌体总蛋白约17.4%左右，菌体OD600达到了12.4，且可溶性达到76.1%（见表1）.

图4 pTf16和pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的乳糖自诱导表达Fig.4 Expressions of pTf16 and pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by Lactose auto－induction

由表1可知采用乳糖自诱导策略，融合蛋白TrxA－FGF－21的可溶性虽只有76.1%，但菌体生物量达到12.4.因此，总的可溶性TrxA－FGF－21表达产量较IPTG诱导的高，按公式：相对产量＝表达量（%）×可溶性（%）×菌体密度OD600，可知IPTG诱导的可溶性TrxA－FGF－21相对产量为0.30，乳糖自诱导的的可溶性TrxA－FGF－21相对产量为1.64，乳糖自诱导的可溶性TrxA－FGF－21产量是IPTG诱导的5.5倍.

表1 IPTG诱导与乳糖自诱导表达FGF－21融合蛋白的比较Tab.1 Comparison of expression TrxA－FGF－21 fusion protein by IPTG and Lactose auto－induction

2.3 融合蛋白TrxA－FGF－21的Western blotting鉴定

利用FGF－21单克隆抗体对表达的融合蛋白进行Western blotting分析，结果表明在全菌液和上清的泳道中约39 kD处有明显的识别条带，即为TrxA－FGF－21融合蛋白（见图5）.

图5 TrxA－FGF－21融合蛋白 Western Blotting鉴定Fig.5 Identification of TrxA－FGF－21 fusion protein by Western Blotting

2.4 FGF－21的降血糖活性检测

纯化后FGF－21在C57BL／6小鼠体内进行降血糖活性测定.

FGF－21给药组在45、60和75 min，均能明显降低小鼠血糖，与对照组相比有显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01），糖耐量得到改善（见图6）.说明本研究方法制备的重组FGF－21蛋白具有降低小鼠血糖的生物学活性.

2.5 FGF－21对脂代谢的影响

对小鼠连续28 d注射FGF－21后，取其血清测定甘油三酯水平，结果表明，给药组能明显降低小鼠甘油三酯水平，与对照组相比有极显著差异（P＜0.01）（见图7）.说明FGF－21参与了脂代谢的调节，可能通过提高脂肪组织中脂肪酶的表达，促进脂肪的分解和生酮作用的发生而降低甘油三酯.

图6 FGF－21在C57BL／6小鼠体内活性测定Fig.6 Determination of activity on mice

图7 FGF－21对C57BL／6小鼠甘油三酯水平影响Fig.7 Effects of FGF－21Triglyceride levels on mice

3 讨 论

利用基因工程能够较快地制备重组蛋白，人源FGF－21在大肠杆菌中主要是以包涵体形式表达［3，6］，难以获得高效稳定的可溶性蛋白.本文利用在线软件（http：／／www.biotech.ou.edu）对FGF－21在大肠杆菌中的可溶性进行了预测，预测结果显示，FGF－21在大肠杆菌中表达不可溶性达到86.2%.于是将FGF－21与硫氧还蛋白A（Thioredoxin A，TrxA）融合表达，通过TrxA提高FGF－21的可溶性.根据pET32a（＋）的结构，将FGF－21基因序列连接在TrxA序列下游合适的位置，利用同样的在线软件对该融合蛋白可溶性进行预测，预测结果显示，加入TrxA后，融合蛋白的可溶性比之前提高，但不可溶性还是达到65.9%.实验结果也表明，融合蛋白主要以包涵体形式存在.

根据文献报道，分子伴侣能够介导蛋白质在生物体内进行正确折叠，获得正确的构型，增强其可溶性等［14］.本研究共转化含有分子伴侣Tig基因的质粒pTf16和重组质粒pET32（＋）a－FGF－21于大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，该分子伴侣pTf16质粒的启动子为araB，可以阿拉伯糖作为诱导物诱导分子伴侣Tig的表达，同时带有氯霉素抗性基因作为筛选标记.结果显示，经阿拉伯糖诱导，分子伴侣Tig表达，并能协助FGF－21正确折叠，表达的FGF－21融合蛋白主要以可溶性形式存在，在IPTG诱导下，FGF－21融合蛋白的可溶性高达92.4%.由于分子伴侣本身是独立表达的，在对目的蛋白纯化的过程中，不需要采用额外的方法来去除分子伴侣蛋白，因此采用本策略在大肠杆菌中表达难溶性蛋白简便、快捷.

另外，在基因工程表达外源目的蛋白时，人们常选用pET系统的质粒，因其含有lacI表达元件，蛋白的表达需要用IPTG诱导，一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性，直接影响目的蛋白的产量.因此，本研究的另一个策略采用乳糖自诱导的方式来提高目的蛋白的产量.在相同影响因素下，本文比较了乳糖自诱导和IPTG诱导的蛋白表达量及产量，发现目的蛋白表达量差异虽不大，但是乳糖自诱导所获得的菌体密度远高于IPTG诱导，约为IPTG诱导的6～7倍，因此，采用乳糖自诱导策略可通过提高生物量来获得更高产量的目的蛋白.

综上所述，分子伴侣协助蛋白表达的方法及乳糖自诱导的策略实现了人源FGF－21在大肠杆菌中的高效可溶性表达，且用此方法获得的重组FGF－21在小鼠体内表现生物学活性，这为基因工程表达难溶性蛋白以及新型治疗2型糖尿病药物FGF－21的研究奠定了一定的基础.

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