反相高效液相色谱法测定石榴籽中鞣花酸的含量

刘振平，陈祥贵*，彭海燕，杨文宇，何宇新，杨 潇，李玉锋

(西华大学生物工程学院，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039)

反相高效液相色谱法测定石榴籽中鞣花酸的含量

刘振平，陈祥贵*，彭海燕，杨文宇，何宇新，杨 潇，李玉锋

(西华大学生物工程学院，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039)

目的：建立检测石榴籽中鞣花酸的含量测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法，Arcus EP-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0.1% TFA溶液为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm。结果：鞣花酸0.004～0.064μg之间线性关系良好，平均加样回收率为100.49%。结论：本方法精密可靠，可作为检测石榴籽中鞣花酸含量的方法。

石榴籽；鞣花酸；反相高效液相色谱法

石榴(Punica granatumL.)在我国多个地区广泛种植，是一种药食两用的植物资源。石榴各部位含有多种功能性成分，具有广泛的药理活性。石榴籽作为石榴的重要部位，其含的多酚是一种强的抗氧化剂，国内外大量的研究表明石榴鞣质在预防和治疗心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等方面具有显著效果[1]。近几年来，“多酚”类保健品在保健品行业越发受到人们关注[2]，石榴籽含有丰富的多酚类成分，有研究表明石榴籽多酚提取物的抗氧化作用强于VE[3]，因此对其保健价值的开发也具有十分重要的意义。目前大多数研究和实践中主要测定石榴籽总多酚，少有对特异性和特征性成分进行测定，尚未见到检测石榴籽中特定酚类成分的报道。本实验采用反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)，建立检测石榴籽中鞣花酸(ellagic acid)的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜石榴，产地四川西昌市；鞣花酸对照品(纯度≥98%) 山东中药化学标准品工程技术研究中心；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；所用水均为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-20AB高效液相色谱系统(SPD-M20A紫外检测器)日本岛津公司；Mnli-Q Biocel超纯水系统美国 Millipore公司；JJ1004小型超声波清洗器 东莞市嘉劲机械有限公司；BS 200S万分之一电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Arcus EP- C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)，0.1%三氟乙酸(TFA)溶液(B)，梯度洗脱条件：0～10min，B 95%～85%；10～16min，B 85%；16～16.5min，B 85%～60%；16.5～36.5min，B 60%；36.5～37min，B 60%～95%；37～45min，B 95%；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：254nm。在此色谱条件下，鞣花酸特征峰峰型良好，其色谱图如图1所示。

图1 鞣花酸对照品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of ellagic acid standard

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取鞣花酸对照品适量溶于甲醇，制成40μg/mL的溶液，取上述对照品溶液100μL稀释至1mL作为对照品溶液，其中鞣花酸质量浓度为4μg/mL，备用。

1.3.3 待测样品的提取

将新鲜石榴去皮去汁，收集石榴籽，常温条件下干燥。将干燥的石榴籽粉碎，过60目筛，参考文献[4]提取方法：取石榴籽粉末2 g，加入甲醇、乙醇、丙酮和水各10mL超声提取30min；取上清液10000r/min离心3min后再取上清液，备用。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

取1.3.2节制备的对照品溶液分别进样1、2、4、6、8、1 2、1 6μL。以进样量/μg为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程分别为：y＝11252.7x－10821.7，r＝0.9995；鞣花酸进样量在0.004～0.064μg之间与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 精密度实验

连续进样样品溶液5次，每次进样量为10μL，得鞣花酸的峰面积的RSD为2.398%，说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验

取样品溶液按上述色谱条件分别在(0、3、6、9、16)h进样，进样量为10μL，计算得鞣花酸的峰面积的RSD为1.352%，说明样品在16h内稳定。

2.4 重复性实验

取石榴籽粉末5份按1.3.3节方法平行制取供试品溶液并测定，鞣花酸峰面积的RSD为0.845%，重复性良好。

2.5 回收率实验

精密称取适量鞣花酸对照品，取已知质量浓度(含鞣花酸36.00μg/g)的供试品6份，加入适量对照品。按照1.3.1节方法测定，计算鞣花酸的回收率为100.49%，RSD为2.816%。

2.6 样品含量测定

按照1.3.3节方法提取后，进样，色谱图如图2所示。结果表明，鞣花酸能很好地与其他成分分离，分离度大于1.5，鞣花酸的含量为36.82μg/g。

图2 样品高效液相色谱图Fig.2 HPLC analysis of the extract from pomegranate seeds

3 讨 论

图3 石榴皮鞣素、安石榴苷、鞣花酸对照品高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of a mixture of punicalin, punicalagin and ellagic acid standard samples at a ratio of 1:3:1

多酚类成分是石榴药用及保健价值的重要物质基础，一般认为以鞣花酸为代表。因此，相对于其他多酚类成分，鞣花酸的药理学、提取和检测方法的研究报道要多得多。研究表明，众多多酚类成分中，人口服后只有鞣花酸可以直接被人体吸收利用[5]。已有多篇文献报道了检测石榴皮中鞣花酸的高效液相色谱法和高效毛细管电泳法[6-7]。Jimenez等[8]通过研究认为以安石榴苷是石榴皮多酚类成分的主体，其含量远高于鞣花酸和石榴皮鞣素，但是，由于石榴部位的不同各多酚类成分的含量可能具有较大的变化。对石榴籽中总多酚含量的测定[9]已有报道，但尚未见到关于石榴籽中特定多酚类成分检测的报道。因此，本实验建立的检测石榴籽中鞣花酸的定量方法对石榴籽的开发及质量评价具有一定的参考意义。结果表明，石榴籽中鞣花酸的含量约为3.6%。如图2、3所示，样品中的石榴皮鞣素和安石榴苷在与对照品相同的保留时间处高效液相色谱分析系统未能检测到石榴皮鞣素和安石榴苷的特征峰，由此可以表明，石榴籽中石榴皮鞣素和安石榴苷的含量远低于鞣花酸或者石榴籽中根本不含有石榴皮鞣素和安石榴苷。因此，可以继续从探索石榴籽中是否含有石榴皮鞣素和安石榴苷甚至更多其他多酚类成分及其定量方法上做进一步研究。

流动相的选择是建立HPLC方法的关键。石榴籽样品中成分复杂，与待检成分性质相似者较多，这些特点都给本检测方法的建立带来了挑战。参考多种石榴多酚类成分检测方法，如李海霞等[10]检测石榴皮中安石榴苷的方法等。最后采用Zhou Hongtao等[11]报道的关于对石榴皮中石榴皮鞣素的分离与纯化以及Lu Jingjing[12]等报道的对石榴皮中安石榴苷的分离与纯化方法中流动相甲醇-三氟乙酸(TFA)(0.1%)，通过优化调整，建立了能很好的将待检测成分分离的色谱条件。

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[4]LI Yunfeng, GUO Changjiang, YANG Jijun, et al. Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract[J]. Food Chemistry, 2006, 96(2): 254-260.

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[7]周本宏, 吴振华, 李小军, 等. 高效毛细管电泳法测定石榴皮中鞣花酸的含量[J]. 中国药房, 2005, 16(24): 1893-1894.

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[12]LU Jingjing, WEI Yun, YUAN Qipeng. Preparative isolation and purification of purification from pomegranate husk by high-speed countercurrent chromatography[J]. J Chromatogr B: Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007, 857(1): 175-179.

Determination of Ellagic Acid in Pomegranate Seeds by RP-HPLC

LIU Zhen-ping，CHEN Xiang-gui*，PENG Hai-yan，YANG Wen-yu，HE Yu-xin，YANG Xiao，LI Yu-feng
(Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Provincial University, School of Bioengineering,Xihua University, Chengdu 610039, China)

Objective: To establish an HPLC method for the determination of ellagic acid in pomegranate seeds. Methods: The chromatographic separation was carried out on an Arcus EP-C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase composed of a mixture of methanol and 0.1% TFA at a flow rate of 1.0 mL/min by gradient elution. The detection wavelength was 254 nm.Results: The linear range was 0.004－0.064 μg for ellagic acid. The average recovery rate was 100.49%. Conclusion: This method is accurate, reproducible and applicable for quality control of ellagic acid in pomegranate seeds.

pomegranate seedsl；ellagic acid；RP-HPLC

R917

A

1002-6630(2012)18-0220-03

2011-07-12

国家星火计划项目(2010GA810002)；四川省科技攻关项目(05SG011-021)

刘振平(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为天然产物与营养保健。 E-mail：nping305@126.com

*通信作者：陈祥贵(1967—)，男，教授，博士后，研究方向为食品营养与生物技术。E-mail：chenxianggui@tom.com