白蚁链霉菌ACT-2菌株抗菌谱及其发酵液抑菌稳定性分析＊

宋迤明， 张晓阳， 董夏梦， 韦 凤，蓝丽精， 蔡琪敏， 蒋冬花

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004;2.金华市环境检测中心，浙江 金华321013)

白蚁链霉菌ACT-2菌株抗菌谱及其发酵液抑菌稳定性分析＊

宋迤明1， 张晓阳2， 董夏梦1， 韦 凤1，蓝丽精1， 蔡琪敏1， 蒋冬花1

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004;2.金华市环境检测中心，浙江 金华321013)

测定了白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株的抗菌谱.结果表明：ACT-2菌株对细菌类病原体有较强的拮抗能力，对真菌类病原菌抑菌效果不显著.以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小种为指示菌，分析了ACT-2菌株发酵液的抑菌稳定性.ACT-2菌株发酵液抑菌稳定性实验显示：在温度低于80℃，4 000 lx光照强度下，ACT-2菌株发酵液能保持稳定的抑菌能力;温度高于90℃时，其发酵液的抑菌能力开始降低;经酸碱处理后，其发酵液的抑菌能力出现了明显的降低.

白蚁链霉菌;白叶枯病;抗菌谱;稳定性

放线菌，尤其链霉菌，广泛存在于土壤环境中，并大范围应用于抗生素的生产［1］.链霉菌菌株可产生约6 550种抗生素类物质，约占由放线菌产生抗生素总量的70%［2-3］.这些抗生素类物质属于链霉菌的次级代谢产物，可以在自然环境中发生降解［4］，且可以特异性地作用于某些病原菌，降低由该病原菌所致病害的发病率.因此，这类链霉菌可作为生防菌，应用于农业生产中［5］.

白蚁链霉菌ACT-2菌株筛选自金华市郊区水稻试验田土壤中，通过打孔法和牛津杯法实验，表明该菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6的生长和繁殖具有较强的抑制作用.本研究对ACT-2菌株的抗菌谱及其发酵液抑菌能力的稳定性进行了探讨，为该生防菌株的应用和发酵液中有效组分的分离纯化、加工储藏提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小种，由浙江师范大学化学与生命科学学院遗传实验室提供;白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株，分离自浙江省金华市郊区水稻试验田;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium semitectum)、番茄早疫病菌(Alternaria sonali)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)由本实验室保存.

1.2 发酵液的制备

从固体培养基白蚁链霉菌ACT-2菌落上刮取少量的孢子，接入装有高氏一号液体培养基的250 mL 摇瓶中(装液量为50 mL，pH 7.2 ～ 7.5)，180 r/min 28℃摇床培养36 h，作为种子液.取100 μL种子培养液，以0.2%的接种量加入到发酵培养基中，250 mL摇瓶装液量为50 mL，发酵液初始pH调至7.5，摇床转速为180 r/min，28℃恒温培养72 h.发酵结束后，将发酵液置于50 mL离心管中10 000 r/min离心10 min，上清液通过孔径为0.22 μm细菌过滤膜过滤，重复2次，除去残余孢子.

1.3 抗菌谱的测定

1.3.1 “十”字交叉法

参见文献［6］.将上述上清液与融化的PDA固体培养基以1∶9的体积比混合均匀，倒入灭菌的培养皿中，制成带药平板.用打孔法移取直径5 mm带有待测病原菌的菌饼到凝固后的培养基上，于28℃培养72 h，用“十”字交叉法测量供试病原菌菌落的生长直径，并计算菌丝生长抑制率.设置3组平行测定，取平均值.

1.3.2 牛津杯法

参见文献［7］.在无菌的培养皿内加入20 mL培养基，凝固后将病原菌培养液均匀涂布在培养基表面，在中心放置1个灭菌的牛津杯，每个牛津杯中加入200 μL白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵液，将培养皿置于28℃恒温培养箱中培养72 h，测定抑菌圈的直径.每个处理重复3次，取平均值.

1.4 ACT-2菌株发酵液抑菌稳定性的分析

1.4.1 热稳定性

将白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵滤液分别置于 50，60，70，80 和90 ℃条件下处理2 h.

1.4.2 酸碱稳定性

分别用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液将ACT-2菌株发酵滤液pH标定至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 和 10.0，处理 2 h，再将发酵滤液调回其原始pH 7.8.

1.4.3 光稳定性

将ACT-2菌株发酵滤液置于光强度为4 000 lx 的光源下，分别照射3，6，9，12，15 和18 h.

以ACT-2菌株原始发酵滤液为对照，以水稻白叶枯病菌P6生理小种作为指示菌，用牛津杯法测定上述经热、酸碱或光照处理发酵滤液的抑菌率，重复3次.

2 结果与分析

2.1 ACT-2菌株发酵液的抗菌谱

由表1可知，ACT-2菌株发酵液对真菌类病原菌具有一定的抑制作用，但是抑菌作用较弱.在所选测试的9种植物病原真菌中，对黄瓜枯萎病菌的抑制作用最强，抑菌率达40.91%;对稻曲病菌的抑制作用最弱，抑菌率为28.73%.

表1 白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵液对植物病原真菌的抑菌率

表2反映了ACT-2菌株发酵液对病原细菌的抑制能力.通过牛津杯法测试，ACT-2菌株发酵液对所选4种病原细菌的抑菌圈直径均达到20.00 mm以上，抑菌效果比较好.

表2 白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵液对病原细菌的抑菌作用

2.2 ACT-2菌株发酵液的热稳定性

图1 ACT-2菌株发酵液在不同温度处理后对白叶枯病菌P6生理小种的抑菌作用

由图1可知：温度为50～70℃时，ACT-2菌株发酵液的抑菌活性与对照相近;当温度升高到80℃时，发酵液的抑菌活性略有下降;当温度升高到90℃时，发酵液的抑菌圈直径为22.00 mm，比对照组(抑菌圈直径为24.83 mm)的抑菌活性有较显著的下降.表明ACT-2菌株发酵液在温度低于80℃环境下有较好的稳定性，但温度高于90℃则可能对发酵液中的活性物质造成一定的破坏.

2.3 ACT-2菌株发酵液的酸碱稳定性

由图2可知：ACT-2菌株发酵液在pH 2.0，3.0，4.0，5.0 和 6.0 环境下处理2 h 后，发酵液的抑菌能力均有一定程度的下降，抑菌圈直径随pH值的降低而减小，在pH 2.0时抑菌圈直径最小，为17.56 mm;当 pH 在9.0 ～10.0 时，抑菌圈直径随着pH值的增大而减小，而且碱性越强抑菌圈直径减小得越多，在 pH 9.0时抑菌圈直径为22.56 mm，在 pH 10.0 时抑菌圈直径为 21.11 mm.ACT-2菌株发酵液在 pH 7.0～8.0时抑菌圈直径没有显著差异.表明ACT-2菌株发酵液活性物质的抑菌能力受酸碱度影响较大，但是由于在pH 2.0和pH 10.0时仍具有一定的抑菌活性，说明该活性物质对酸碱环境仍具有一定的耐受性.

图2 ACT-2菌株发酵液在不同酸碱环境处理后对白叶枯病菌P6生理小种的抑菌作用

图3 ACT-2菌株发酵液在不同时间光照处理后对白叶枯病菌P6生理小种的抑菌作用

2.4 ACT-2菌株发酵液的光稳定性

由图3可知，白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵液于28 ℃下用 4 000 lx光照处理 3，6，9，12，15 和18 h后，发酵液的抑菌能力没有显著差异.表明ACT-2菌株发酵液中的抑菌物质对光较稳定.

3 讨论

研究结果表明，白蚁链霉菌ACT-2菌株对多种导致植物病害的病原菌均有一定程度的抑制作用，尤其是对细菌类病原菌的作用效果更明显.国内有一些有关放线菌抑菌作用的相关报道，如邵彦坡等［8］发现的海洋放线菌B5菌株和张玲玲等［9］发现的土壤放线菌C3-1菌株等，对真菌类病原菌表现出比较强烈的抑制作用.与这些报道不同的是，白蚁链霉菌ACT-2菌株筛选自金华市郊外水稻试验田，对细菌类病原菌表现出较强的拮抗作用.因此，开发利用白蚁链霉菌ACT-2菌株防治水稻白叶枯病菌具有较好的前景.

嵇豪等［10］的研究发现，生物活性物质的加工和储藏容易受到该物质稳定性的影响;汪茜等［11］认为生物活性物质能否发挥有效作用与其自身的稳定性有密切关系.通过对白蚁链霉菌ACT-2菌株发酵液稳定性的研究，表明该菌株发酵液对光照和温度表现出较好的稳定性，可以耐受一定程度的高温;对酸碱度的耐受性稍差一些，本研究数据显示，ACT-2菌株发酵液的抑菌活性下降幅度并不明显，稳定性较高.这使该菌株发酵液的生防应用，以及其中有效组分的分离纯化和加工储藏成为可能.

［1］Merav K，Marianna O，Ilan C h，et al.Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases［J］.Soil Biol Biochem，2003，35：323-331.

［2］Bérdy J.Bioactive microbial metabolites［J］.J Antibiot，2005，58(1)：1-26.

［3］Piyapat S，Somboon T，Khanit S.16S rDNA sequence analysis and antimicrobial activities of Streptomyces strains from Thai soils［J］.J Health Res，2008，22(1)：1-8.

［4］Zhao Zhenzhen，Wang Qiushuo，Wang Kaimei，et al.Study of the antifungal activity of Bacillus vallisortis ZZ185 in vitro and identication of its antifungal components［J］.Bioresoure Technol，2010，101(1)：292-297.

［5］Paulitz T C，Belanger R R.Biological control in greenhouse systems［J］.Annu Rev Phytopathol，2001，39：103-133.

［6］刘晓妹，陈秀蓉，蒲金基.两株芽孢杆菌无菌液抗菌谱及稳定性测定［J］.中国生物防治，2003，19(3)：141-143.

［7］刘冬梅，李理，杨晓泉.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力［J］.食品研究与开发，2006，27(3)：110-111.

［8］邵彦坡，方丽萍，魏少鹏，等.海洋放线菌B5菌株发酵液抗菌谱及稳定性研究［J］.西北农业学报，2007，16(3)：248-251;256.

［9］张玲玲，董美玉，许凤春，等.放线菌C3-11的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究［J］.现代农业科技，2009(3)：109-113.

［10］嵇豪，蒋冬花，杨叶，等.响应面法优化超声波辅助提取红曲米中水溶性色素［J］.浙江师范大学学报：自然科学版，2011，34(1)：91-96.

［11］汪茜，胡春锦，柯仿钢，等.生防菌株1404的鉴定及其对采后柑橘炭疽病的防治效果［J］.微生物学报，2010，50(9)：1208-1217.

Antimicrobial spectrum of Streptomyces termitum strain ACT-2 and antibacterial stability of its fermentation broth

SONG Yiming1， ZHANG Xiaoyang2， DONG Xiameng1， WEI Feng1，LAN Lijing1， CAI Qimin1， JIANG Donghua1

(1.College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Environmental Monitoring Center of Jinhua，Jinhua Zhejiang 321013，China)

The results of bacteriostasis experiments demonstrated that strain ACT-2 suppressed a wide range of bacterial pathogens in vitro，while no obvious antimicrobial activities towards fungal pathogens.Antibacterial stability of Streptomyces termitum strain ACT-2 fermentation broth was studied while Xanthomonas oryzae pv.oryzae physiological strain P6 was chosen as indicator bacteria.The fermentation broth could show obvious bacteriostatic activity when the tempreture was below 80℃or exposured in the 4 000 lx illuminant;the diameter of inhibition zone decreased when the tempreture came up to 90℃.The fermentation broth was sensitive to acidity and alkalinity，the activity decreased after treatment.

Streptomyces termitum;bacterial leaf blight;antimicrobial spectrum;stability

Q939.92

A

2012-02-14

浙江省公益性技术应用研究计划项目(2010C32076)

宋迤明(1986－)，男，山东梁山人，硕士研究生.研究方向：应用微生物学.

蒋冬花.E-mail：jdh@zjnu.cn

(责任编辑 薛 荣)