锦灯笼酸浆宿萼皂苷提取工艺的研究

孟庆然，耿红兰，任石涛 ，王晓闻

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801）

皂苷是一类非挥发性、表面活性化合物，在自然界中分布广泛，主要存在于植物中。因其水溶液具有起泡性，故称之为皂苷［1］。皂苷具有多种属性，包括甘苦性［2，3］、发泡性和乳化性、药理特性和药用性质［4］、溶血特性［5］、以及抗菌、杀虫、灭软体动物活性［5～7］等。皂苷在饮料和糕点及化妆品和医药产品中有着广泛应用［5，8］。虽然目前对酸浆草、宿萼及其果实的研究较多［9，10］，然而有关锦灯笼宿萼皂苷提取工艺的研究尚未见报道。因此，本文以锦灯笼宿萼为实验材料探讨锦灯笼宿萼皂苷的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料

锦灯笼酸浆宿萼粉末：原料采自山西省阳高县王官屯镇。将去除萼内浆果的原料于60℃条件下烘干，然后经粉碎、40目过筛即得锦灯笼酸浆宿萼粉末。

1.1.2 试验试剂

95%的乙醇，工业级；AR级的石油醚、正丁醇、乙醚、无水甲醇、无水乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸。薯蓣皂苷标准品：天津马克生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器及设备

FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；R－1001 N旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；SHB－Ⅲ循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DLSB5／10低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；WB－2000水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；XMTB数显温控仪（江苏金坛中大仪器厂）；723可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；UV－LS－30紫外可见分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）；LD4－2 A低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；SHY－2 A水浴恒温振荡器（江苏金坛市金城国胜试验仪器厂）；BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；101－3－BS－Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 皂苷含量的测定

采用香草醛一高氯酸法［11］：取一定体积的皂苷溶液，置于10 mL具塞试管中，60℃水浴挥干溶剂，然后加入0.20 mL 5%的香草醛一冰醋酸溶液和0.80 mL高氯酸，密塞摇匀，置于70℃水浴中振荡加热15 min，取出后立即用冰水冷却，加入5.00 mL冰乙酸混匀，静置20 min，以不加样品的平行样作为空白，在最大吸收波长处测量吸光度值。

1.2.2 标准溶液的制备

精确称取薯蓣皂苷标准品2.5 mg，用无水乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 g·L－1薯蓣皂苷标准溶液。

1.2.3 最大吸收波长的确定

取1.2.2薯蓣皂苷标准液0.5mL，按照

1.2.1 的方法进行处理，用紫外一可见分光光度计对混匀静置后的液体进行全波长扫描，根据扫描吸收光谱确定其最大吸收峰的波长。

1.2.4 薯蓣皂苷标准曲线的绘制

准确移取薯蓣皂苷标准溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL于10 mL具塞试管中，每组5个平行，按照1.2.1的方法进行处理，在1.2.3所测得的最大吸收波长处测量吸光度值。以吸光度（A）为纵坐标Y，薯蓣皂苷的质量（μg）为横坐标X做标准曲线，并建立回归方程。见图1。

1.2.5 样品液的制备及总皂苷含量的测定

参照刘雅丽等［12］的方法。精确称取2 g原料于圆底烧瓶中，用乙醇回流提取两次，合并滤液，3500 r·min－1条件下离心10 min，取上清减压蒸干；用10 mL蒸馏水溶解提取物，加等体积的石油醚和水饱和正丁醇各萃取3次；合并正丁醇相并减压蒸干，用5 mL甲醇溶解沉淀；加8倍体积乙醚洗涤，3000 r·min－1离心10 min，洗涤3次，即得粗皂苷。将粗皂苷定容于50 mL容量瓶中即得样品液。精确量取样品溶液1 mL，5个平行，按照1.2.1的方法测定吸光度值，根据回归方程计算总皂苷含量。

图1 薯蓣皂苷标准品标准曲线Fig.1 Standard curve of diosgenin saponins

1.2.6 最佳提取工艺的确定

1.2.6.1 乙醇浓度的确定

分别 用 40%、50%、60%、70%、80%、90% 的乙醇，其他条件固定，按照1.2.5的方法提取并测定粗皂苷含量，筛选最佳乙醇提取浓度。

1.2.6.2 提取温度的确定

分别在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下，其他条件固定，按照1.2.5的方法提取并测定粗皂苷含量，筛选最佳提取温度。

1.2.6.3 提取时间的确定

将宿 萼 分 别 提 取 30、60、90、120、150、180 min，其他条件固定，按照1.2.5的方法提取并测定粗皂苷含量，筛选最佳提取时间。

1.2.6.4 料液比的确定

以1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的料液比进行提取，其他条件固定，按照1.2.5的方法提取并测定粗皂苷含量，筛选最佳提取料液比。

1.2.6.5 最佳提取条件的确定

根据上述单因素试验结果设计正交试验因素水平表，进行L9（34）正交试验，以确定锦灯笼酸浆宿萼总皂苷的最佳提取工艺。

1.2.7 样品溶液稳定性试验

精确量取一定体积的样品溶液，按照1.2.1的方法测定吸光度值，每隔5 min测定一次，观察样品溶液在60 min之内的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长的确定

可见光光谱扫描结果见图2。

薯蓣皂苷标准品加香草醛一高氯酸显色后在400～700 n m波长下进行扫描。由图2可见，薯蓣皂苷标准品在464 n m处有最大吸收峰，故本试验选用464 n m为测定波长。

图2 薯蓣皂苷标准品全波长扫描图Fig.2 Wavelength scanning results of diosgenin saponins standard product

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同的乙醇浓度对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响

由图3可见，相同的条件下，随着乙醇浓度的增大，总皂苷的得率先逐渐增加而后降低，80%的乙醇对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷的提取效果最好。

图3 乙醇浓度对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate

2.2.2 不同的提取温度对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响

由图4可见，相同的条件下，随着提取温度的升高，总皂苷的得率先逐渐增加而后降低并逐渐趋于稳定。60℃时锦灯笼酸浆宿萼总皂苷的提取率最高，故最佳提取温度在60℃左右。

图4 提取温度对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate

2.2.3 不同的提取时间对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响

由图5可见，相同的条件下，在30～120 min内，随着时间的延长，总皂苷的得率先逐渐增加而后基本相同。因此，总皂苷的最佳提取时间在120 min左右。

图5 提取时间对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响Fig.5 Effect of time on the extraction rate

2.2.4 不同的料液比对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响

图6 料液比对锦灯笼酸浆宿萼总皂苷提取率的影响Fig.6 Effect of liquid－solid ratio on the extraction rate

由图6可见，相同的条件下，随着料液比的增加，总皂苷的得率逐渐增加，但到一定的程度时，得率趋于稳定。料液比过大，会增加下一步浓缩的困难，消耗更多的时间和能量，因此，料液比选1∶8左右较为适宜。

2.3 正交试验结果

正交试验因素及水平设计见表1，正交试验结果及方差分析见表2、表3。

由表2可见，影响锦灯笼酸浆宿萼皂苷提取率的因素顺序依次为乙醇浓度、料液比、提取温度、时间。由此正交试验得出的最优提取工艺组合为A2B2C2D3，80%的乙醇，60℃，120 min，1∶9的料液比。此条件下总皂苷的得率为4.283 mg·g－1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels in L 9（3 4）orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table 2 Results oforthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表3方差分析可以看出，乙醇浓度、温度和料液比对粗皂苷得率的影响差异极显著，而时间的影响差异不显著。从节约成本、缩短提取时间的角度考虑可以采用105 min的提取时间。

2.4 样品溶液稳定性试验

1 h内供试样品的稳定性见图7。

由计算可得，1小时内，A1组、A2组和A3组吸光度值的下降率分别为0.98%、0.89%和0.78%，3组吸光度值平均下降率为0.883%。吸光度下降率较小（SD＝1%），在测试时间内基本稳定。

3 结论

锦灯笼酸浆宿萼皂苷回流提取的最优工艺条件为：乙醇浓度为80%、提取温度60℃，提取时间105 min，料液比1∶9。此条件下总皂苷得率较高，且性质稳定。

图7 供试样品稳定性曲线Fig.7 The stability curve of samples

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