响应面分析法优化当归多糖提取工艺

王艳艳，王团结*，丁琳琳

(1.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏 连云港 222006；

2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；3.天津红日药业股份有限公司，天津 301700)

WANG Yan-yan1，WANG Tuan-jie2,*，DING Lin-lin3

(1. Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China；

3. Tianjin Chasesun Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin 301700, China)

响应面分析法优化当归多糖提取工艺

王艳艳1，王团结2,*，丁琳琳3

(1.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏 连云港 222006；

2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；3.天津红日药业股份有限公司，天津 301700)

目的：优选当归多糖的提取工艺。方法：以当归多糖为评价指标，通过响应面分析法优化当归多糖的提取工艺，并对最佳提取工艺进行验证实验。结果：当归多糖的最佳提取工艺为每次提取时间2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取3次。结论：采用响应面分析法优化对当归多糖提取条件进行优化合理可行。

响应面；当归；多糖；提取工艺

WANG Yan-yan1，WANG Tuan-jie2,*，DING Lin-lin3

(1. Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China；

3. Tianjin Chasesun Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin 301700, China)

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

当归产自甘肃，烘干，备用；95%酒精、浓硫酸(95%～98%)、蒽酮均为分析纯；双蒸水(自制)。

UV-9600型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；BC-R5001旋转蒸发器 上海贝凯生物化工设备有限公司；HHS-1型电热恒温水浴锅 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；CT-C热风循环烘箱 南京千方臭氧设备厂；LD5-2A型离心机 北京医用离心机厂；B3200S超声清洗机 必能信超声上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量测定标准曲线

称取50.00mg蒽酮用76%稀硫酸(76mL浓硫酸加入30mL水中)定容到50mL备用。称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖25.00mg，加蒸馏水定容于25mL，配成1mg/mL的标准溶液备用。精密吸取标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于25mL容量瓶中，加蒸馏水定容摇匀，再分别吸取各质量浓度葡萄糖溶液1mL，加5mL蒽酮试液，立即放入冰水浴中摇匀后，置沸水浴中煮10min，取出用水冲洗2min冷却，静置10min后于波长624nm处测定吸光度，以蒸馏水1.0mL作空白对照。以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做回归处理，得回归方程为y＝0.0047x＋0.0325，R＝0.9991，线性范围20～120μg/mL。

1.2.2 当归多糖的提取方法[7-15]

面瘫(PFP),即周围性面神经炎,是临床常见的多发性面部神经病变,是茎乳孔内急性非化脓性炎性病症。临床症状主要是蹙额力减弱、眼睛不能完全闭合、口角下垂等,对患者的生活造成很大影响。而难治性PFP是因多种疗法治疗效果差迁延(3个月以上)所致,是一种难治性病症。穴位针刺是治疗面瘫常用方法,报道治愈率在60%~70%[1]。近年来,NMES在临床上逐步应用开来,在改善中枢神经功能和重塑周围神经功能方面效果确切。本文主要探讨上述两种方法治疗难治性PFP的临床效果,报告如下。

当归粉碎，过40目筛，称取5.0g当归至250mL圆底烧瓶，加100mL乙醇(80%)，于80℃水浴中加热回流1.5h，抽滤，弃去滤液，得滤渣，至250mL圆底烧瓶，加入蒸馏水，于80℃水浴中加热回流，滤液至250mL容量瓶中，定容，取4mL定容到100mL容量瓶中，用作标准曲线的方法测吸光度，计算提取率。

1.2.3 样品多糖含量及得率测定

按照1.2.1节方法测定其吸光度，计算样品中多糖含量和样品中多糖得率。

1.2.4 单因素试验

分别以不同的提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)，不同提取次数(1、2、3、4、5次)，选择不同的料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10)为单因素，考察不同单因素对多糖得率的影响。

1.2.5 响应面优化试验

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取对当归多糖得率有较显著影响的3个因素，即提取时间、料液比、提取次数。在单因素试验的基础上，设计三因素三水平的响应面分析试验方案，因素及水平见表1。其中编码值与真实值换算关系，提取时间X1＝(T－2)/0.5；料液比X2＝(V－40)/5(注：料液比1∶8时加液为40mL)；提取次数X3＝(n－2)/1。

表1 响应面分析因素与水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 提取时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide

图1表明，提取时间在2h内，多糖得率有所增加，但2h后多糖得率降低，因此将提取时间应控制在2h左右。这种现象的发生提示在提取过程中提取时间太长会使多糖在高温提取过程中的时间过长，而使部分多糖破坏和降解，多糖得率降低，有待进一步证实[16]。

图2 提取次数对多糖得率的影响Fig.2 Effect of times of extraction on extraction yield of polysaccharide

图2表明，提取次数为2次时，多糖得率较高，考虑到提取次数越多，消耗越大且浓缩时损耗也较大，因此选择提取次数2次最佳。

图3 料液比对多糖得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharide

图3表明，不同料液比对得率多糖量的影响较大，料液比在1∶8时，多糖得率最高[17]。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果

采用表1设置的三因素三水平，根据测得的正交试验数据和验证实验数据，进行12组试验，其中1～9是析因试验，10～12是中心试验，用来估计试验误差。结果见表2。

表2 当归多糖提取工艺优化响应面试验设计及结果Table 2 Trials of response surface analysis and experimental results

经Statistica 6.0响应面分析后，其方差分析结果见表3，Pareto图见图4。

表3 当归多糖得率的全模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation for extraction efficiency of Angelica sinensis polysaccharide

由表3可看出，除了料液比与提取次数的共同作用项的P＞0.05，其他各项P＜0.05，其中X12、X22、X1X3、X2X3影响显著，X2、X3、X32、X1X2影响极显著。回归方程相关系数R＝0.99942，说明响应值的变化有99.942%来自于所选变量。由图4可知，所选因素的影响次序为提取次数＞提取时间＞料液比。但是当3个因素联合作用时，对得率的影响都比较显著。

图4 当归多糖提取回归分析结果Fig.4 Analysis of variance of regression for extraction result of Angelica sinensis polysaccharide

2.2.2 当归多糖的提取最佳工艺条件确定

图5 各两因素交互作用对多糖得率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interaction on extraction yield of Angelica sinensis polysaccharide

表4 最优值分析结果表Table 4 Analysis results of optimal value

由图5及表4分析可知，当归多糖得率最优值4.94%，X1＝0.297、X2＝0.273、X3＝0.880，计算得本试验各因素最优值为提取时间2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取次数 2.88(即提取次数取3次。)

2.2.3 验证实验

取5.0g当归粉末用100mL的80%乙醇在80℃水浴中加热提取1.5h，抽滤，弃去滤液，得滤渣；再用1∶8.27的蒸馏水量，在80℃条件下，提取2.15h，最后抽滤得滤液，重复提取3次，转到250mL的容量瓶中，定容，取出4mL定容到100mL容量瓶，按绘制标准曲线的方法测其吸光度为0.402，即可算得提取率为4.91%。

3 结 论

本实验优化了回流法提取当归中多糖工艺，考察提取时间、料液比、提取次数3个因素对当归多糖得率的影响。在单因素试验的基础上进行响应面优化试验设计，以提取率为指标考察提取当归多糖的最佳提取工艺，各因素对提取率的影响为：提取次数＞提取时间＞料液比，其中提取次数是影响当归多糖提取的关键因素。最佳工艺条件为提取时间2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取次数3次，此时提出率可达4.91%。本实验优化得出的当归多糖提取工艺，可为开发利用当归资源提供基础。

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Optimization of Polysaccharide Extraction fromAngelica sinensisUsing Response Surface Methodology

Objective∶ To research the optimal extraction conditions of polysaccharide fromAngelica sinensis. Methods∶Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the best extraction conditions, and then verified the optimal conditions. Results∶ The optimal conditions were as follows∶ the time for 2.15 h, solid-liquid ratio at 1∶8.27, and extraction times for 3 times. Conclusion∶ It is feasible to optimize the extraction processing of polysaccharide fromAngelica sinensisby RSM.

response surface methodology；Angelica sinensis；polysaccharide；extraction

R284.2

A

1002-6630(2012)10-0146-04

2011-04-18

王艳艳(1981—)，女，讲师，硕士，研究方向为药剂学、制药设备、分析化学。E-mail：wyy8127@163.com

*通信作者：王团结(1986—)，男，工程师，硕士，研究方向为中药效应物质基础。E-mail：union_wang@163.com