响应面法优化超声波辅助提取胡桃楸种仁壳总黄酮工艺

徐红艳，包怡红 ，杨丽芸

(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040;2.延边大学农学院，吉林延吉 133000)

响应面法优化超声波辅助提取胡桃楸种仁壳总黄酮工艺

徐红艳1，2，包怡红1，*，杨丽芸1

(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040;2.延边大学农学院，吉林延吉 133000)

为确定胡桃楸种仁壳总黄酮超声波辅助提取的最佳工艺条件，以总黄酮得率和总还原力为指标，进行单因素实验，并在此基础上，选取超声波功率、超声波时间、料液比为影响因素，采用响应面法进行优化并得到回归模型。结果表明:最优工艺条件为超声波功率250W，超声波时间31min，料液比1∶31(g/mL)。回归模型预测的黄酮得率理论值为6.70mg/g，经验证实验，RSD为1.47%，该回归方程与实际情况拟合较好。

胡桃楸，种仁壳，总黄酮，响应面法，超声波法

胡桃楸(Juglans mandshurica)又名山核桃、核桃楸、楸树，为胡桃科胡桃属落叶乔木。主要分布于辽宁、吉林、黑龙江、河北、山西以及甘肃等地，在东北集中于小兴安岭、完达山脉、长白山区及辽宁东部，在大兴安岭林区东南部也有少量分布［1］。胡桃楸种子作为林业副产品，因其种仁富含蛋白质、不饱和脂肪酸，以及多种维生素、氨基酸和钙、铁、磷等多种微量元素，早已成为人们的食疗佳品［2］，成为研究和关注的热点。但在种仁加工过程中，产生大量的种仁壳废弃物，目前极少部分的种仁壳做烧材或加工成工艺品，而大量的种仁壳则丢弃不用，远远没有实现胡桃楸种子的综合开发利用，而对胡桃楸种仁壳活性成份的研究更罕见报道。黄酮类物质是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒等作用［3］;因具有清除自由基的抗氧化活性，使其成为天然抗氧化剂的来源。响应曲面法(response surface methodology，RSM)是利用统计软件进行合理的实验设计，通过多元二次回归方程来拟合变量因素与响应值之间的函数关系，从而优化工艺参数的统计分析方法。目前已在诸多领域得到应用［4－5］。超声波提取是应用超声波强化提取植物的有效成分，是一种物理破碎过程，对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用［6］。因其操作简便快速，提取率高，效果好，并且提取物结构未被破坏，已在生物碱［7］、花色苷［8］、多酚［9］、类黄酮［10］等多种天然产物提取中显示出明显的优势。本实验以胡桃楸种仁壳为原料，采用超声波辅助方法提取总黄酮，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化其最佳提取工艺，旨在为胡桃楸种仁壳的综合开发利用及其活性成份的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胡桃楸种子 由黑龙江省牡丹江地区林业局提供;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 均为分析纯。

KQ－500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE－52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TU－1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种仁壳总黄酮提取 将胡桃楸种子去仁除杂质，粉碎过60目。取2.5g种仁壳粉，加乙醇并密封，室温浸泡1h后于55℃下超声波辅助提取，真空抽滤、减压浓缩并将提取液定容至100mL备用。

1.2.2 标准曲线绘制［11］准确称取芦丁标准品5.0mg，用60%乙醇定容 50mL，配制质量浓度为0.10mg/mL的芦丁标准溶液。精确移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的芦丁标准溶液于 10mL容量瓶中，分别用60%乙醇补至3mL，再分别向各容量瓶中加5% 的 NaNO2溶液 0.4mL，摇匀，静置 6min;加10%的Al(NO3)3溶液0.4mL，摇匀，静置6min;最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，定容至刻度，放置20min，在510nm波长处测定其吸光度，以芦丁质量浓度X(mg/mL)为横坐标、以吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线回归方程为 Y=13.536X－0.0005，相关系数 R2=0.9994。

1.2.3 提取液总黄酮得率的测定 采用NaNO2－Al(NO3)3比色法［12］，按式(1)计算总黄酮得率:

式中:c为按标准曲线求出的总黄酮质量浓度，mg/mL;n为样品液测定时的稀释倍数;v为样品液的体积，mL;m为取样品的质量，g。

1.2.4 Fe3+总还原力的测定 采用铁氰化钾还原法［13］，向试管中加入提取液2mL，再分别加入pH6.6的磷酸缓冲液2.5mL、5%铁氰化钾2.5mL，混匀后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混匀并离心10min(4000r/min)。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水，再加入0.5mL三氯化铁显色，静置10min，700nm波长处测定其吸光值A1，以蒸馏水代替提取液为A0，Fe3+总还原力=A1－A0，越大说明 Fe3+总还原力越强。

1.2.5 单因素实验 以超声波功率、超声波时间、乙醇浓度、料液比为单因素，以总黄酮得率和Fe3+总还原力为指标，进行胡桃楸种仁壳总黄酮提取的单因素实验。

1.2.6 响应面优化实验设计 根据Box－Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法。在单因素实验的基础上，以60%乙醇为提取剂，选择超声波功率、超声波时间和料液比3个因素为自变量，具体设计见表1。以总黄酮得率为响应值，采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，实验设计与统计分析采用Minitab15软件。

表1 Box－Behnken实验因素与水平编码Table 1 Experimental factors and level coding of Box－Behnken

1.2.7 响应面优化工艺验证实验 按响应面优化的最佳工艺条件，提取胡桃楸种仁壳总黄酮，进行3次平行实验，考察响应面优化工艺条件的重现性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声波时间对总黄酮得率和总还原力的影响

称取2.5g种仁壳粉，按料液比1∶30加入60%乙醇，超声功率300W，考察超声波时间对总黄酮得率和总还原力的影响，结果见图1。

图1 超声波时间对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.1 Effect of time of ultrasonic－assisted extraction on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如图1所示，随着超声波时间的延长，总黄酮得率和总还原力增加，在30min时达到最大，之后超声波时间延长，但总黄酮得率和总还原力呈下降趋势，且总还原力下降幅度更大。故选30min为最佳提取时间。

2.1.2 超声波功率对总黄酮得率和总还原力的影响

称取2.5g种仁壳粉，按料液比1∶30加入60%乙醇，超声时间30min，考察超声波功率对总黄酮得率和总还原力的影响，结果见图2。

图2 超声波功率对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.2 Effect of power of ultrasonic－assisted extraction on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

随着超声波功率增大，机械振动作用和空化作用都加强，总黄酮得率和总还原力增加，如图2所示，当超声波功率在250W时，总黄酮得率和总还原力达最大值，之后随功率的增加，总黄酮得率和总还原力都下降。故选250W为最佳提取功率。

2.1.3 乙醇浓度对总黄酮得率和总还原力的影响称取2.5g种仁壳粉，加入不同浓度的乙醇溶液，按料液比1∶30，超声时间30min，超声波功率250W，考察乙醇浓度对总黄酮得率和总还原力的影响，结果见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.3 Effect of concentration of ethanol on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如图3所示，随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率增加，总还原力变化不大;当乙醇浓度为40%、50%、60%时，总黄酮得率和总还原力基本相同;之后随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率和总还原力都急剧下降。由于在实际操作中，乙醇浓度越低，真空抽滤越困难，可能是由于糖类等水溶性物质过多溶出的缘故，故选60%乙醇为最佳提取剂。

2.1.4 料液比对总黄酮得率和总还原力的影响 称取2.5g种仁壳粉，按不同料液比加入60%乙醇溶液，超声波时间30min，超声波功率250W，考察料液比对总黄酮得率和总还原力的影响，结果见图4。

图4 料液比对胡桃楸种仁壳总黄酮得率和总还原力的影响Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如图4所示，随着料液比的增大，总黄酮得率和总还原力都呈增加的趋势，当料液比小于1∶30时，增加幅度较大，之后增加缓慢，故选1∶30为最佳提取料液比。

2.2 响应面法优化胡桃楸种仁壳总黄酮提取工艺

根据表2进行实验，对实验结果回归拟合所得回归模型为:

由表3、表4可知，相关系数R2=96.49%;响应面回归模型极显著(p=0.004);模型失拟项不显著(p=0.722)，说明该二次模型可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，能够拟合真实的实验结果。

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 Design proposal and results of response surface experiment

表3 响应面分析优化后模型的系数检验Table 3 Coefficient test of optimal mode by response surface methodology

表4 响应面优化回归方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of optimal regression equation by response surface methodology

图5～图7分别为超声波功率、超声波时间、料液比三因素影响总黄酮得率的响应曲面图。

综合分析响应面实验结果可知，料液比对黄酮得率的影响最大，次之是超声波时间，超声波功率影响较小。依据回归模型的数学分析确定超声波辅助提取胡桃楸种仁壳黄酮的最佳工艺参数为:超声波功率255.7W，超声波时间31.2min，料液比1∶31.4。回归模型预测的黄酮得率理论值为6.70mg/g。

图5 Y=f(X1，X2)响应曲面图Fig.5 Respone surface plot for Y=f(X1，X2)

图6 Y=f(X1，X3)响应曲面图Fig.6 Respone surface plot for Y=f(X1，X3)

图7 Y=f(X2，X3)响应曲面图Fig.7 Respone surface plot for Y=f(X2，X3)

2.3 响应面分析最优条件的验证实验

响应面优化的超声波辅助提取胡桃楸种仁壳黄酮的最佳工艺参数为:超声波功率255.7W，超声波时间31.2min，料液比1∶31.4。综合实际操作，最终确定最佳工艺参数为超声波功率250W，超声波时间31min，料液比1∶31。以最佳工艺参数做3次平行实验，黄酮得率分别为6.63、6.65和6.59mg/g，平均得率为 6.62mg/g，与理论预测值 6.70mg/g相比，相对标准偏差为1.47%，可见该模型能较好地模拟和预测超声波辅助提取胡桃楸种仁壳黄酮的提取效果。

3 结论

经响应面法优化的胡桃楸种仁壳黄酮超声波辅助提取工艺条件为:超声波功率250W，超声波时间31min，料液比 1∶31。验证实验的黄酮得率为6.62mg/g，与预测值之间的相对标准偏差较小，证明响应面分析法得到的胡桃楸种仁壳黄酮提取条件是真实可靠的。

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Optimization of ultrasonic－assisted extraction of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica by response surface methodology

XU Hong－yan1，2，BAO Yi－hong1，*，YANG Li－yun1
(1.Forestry College of Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133000，China)

To optimize extraction yield of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica under ultrasonic assistance，single factor test were carried out at extraction yield of total flavonoids and total reducing power as index.Based on this，power of ultrasonic－assisted extraction，time of ultrasonic－assisted extraction and solid－toliquid ratio were selected as variables.And a mathematical model was obtained according to response surface methodology.Results showed that the following optimum parameters:power of ultrasonic－assisted extraction，250W;time of ultrasonic－assisted extraction，31min;and solid－to－liquid ratio，1∶31(g/mL).The predicted value of extraction yield of total flavonoids was 6.70mg/g.After confirmatory test，the relative standard deviation was 1.47%.The regression equation was fitting better with actual situation.

Juglans mandshurica;seed shell;total flavonoids;response surface methodology;ultrasonicassisted extraction

TS255.1

B

1002－0306(2012)17－0248－04

2012－02－23 *通讯联系人

徐红艳(1975－)，女，博士研究生，讲师，主要从事天然产物转化与功能性食品研究。

中央高校基本科研业务费专项(LD09C14)。