氨基酸与丙二醛反应体系的荧光光谱

孙艳辉，孟金秀，贾小丽，彭曼莉

（滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239012）

氨基酸与丙二醛反应体系的荧光光谱

孙艳辉，孟金秀，贾小丽，彭曼莉

（滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239012）

采用荧光光谱法研究氨基酸与丙二醛的反应，考察反应时间、pH和浓度对赖氨酸与丙二醛反应体系发射光谱的影响，并对不同种类的氨基酸与丙二醛反应进行比较。结果表明，氨基酸与丙二醛反应生成了400nm激发、460nm发射的荧光物质，该反应在中性条件下易于进行，并随时间延长产物增多，反应体系中，丙二醛浓度高于赖氨酸浓度有利于生成荧光产物。不同氨基酸与丙二醛反应产物的荧光强度差异明显，精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等五种氨基酸易与丙二醛反应，脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸未能与丙二醛反应生成荧光物质。

赖氨酸，丙二醛，氨基酸，荧光光谱

食品在加工贮藏过程中易发生脂肪氧化，造成营养物质损失和异味产生；同时，脂肪氧化次级产物攻击蛋白质，引起氨基酸侧链修饰、蛋白质主链断裂和蛋白质分子间共价交联[1-2]。其中，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是最重要的脂肪氧化次级产物，具有很强的生物反应活性，几乎能攻击所有的生物大分子，导致其结构的改变和功能的丧失[3-4]。贺洪等[5]采用紫外吸收光谱研究了赖氨酸对丙二醛的清除作用，发现在400nm处产生了新的吸收峰。Glomb M A等[6]的研究表明，在室温和中性pH条件下MDA能与生物分子中的氨基特别是精氨酸，组氨酸，赖氨酸残基反应，引起蛋白交联。邓燕等[7]的研究表明MDA与牛磺酸反应产生一种类似脂褐素（Ex.392～395nm/Em.456～364nm）的荧光产物1，4-二氢吡啶衍生物。这些研究仅对部分氨基酸或蛋白质中的氨基酸残基进行研究，而采用荧光分析方法对全部自由氨基酸与MDA反应的研究尚未见报道。因此，本文采用荧光光谱法对自由氨基酸与MDA的反应进行探讨，先系统考察pH、时间、浓度对赖氨酸与MDA反应的产物荧光强度的影响，进而考察不同种类的氨基酸与MDA反应的荧光产物情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

十九种氨基酸 北京科康生物科技有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷 阿拉丁试剂有限公司；盐酸等 均为分析纯。

Cary eclipse型分子荧光分光光度计 Varian，美国瓦里安公司；精密天平，恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 MDA的配制 按照王爱国[8]的方法，先配制1.5×10-4mol的1，1，3，3-四乙氧基丙烷水溶液，加入1mol/L盐酸1m L和超纯水50m L，将溶液在50℃的水浴中放置1h，即成MDA溶液。1mol的1，1，3，3-四乙氧基丙烷完全水解后可得1mol的MDA。冷却后定容至100m L，4℃冷藏保存。

1.2.2 反应体系的配制 将MDA和氨基酸按1∶1摩尔比配制，去离子水分别定容至刻度，摇匀，置于37℃恒温水浴锅中反应1h，水浴冷却至25℃后测定荧光光谱。

1.2.3 荧光光谱的绘制 以400nm为激发波长，420～600nm波长范围内扫描得到荧光发射光谱；以460nm为发射波长，350～450nm波长范围内扫描得到荧光发射光谱；固定Δλ=60nm，在240～700nm波长范围内进行扫描得到同步荧光光谱；扫描时激发狭缝5nm，发射狭缝10nm。波长扫描速度为600nm/min。

1.2.4 pH对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响 采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节赖氨酸MDA反应体系的pH为1.8、2.2、2.6、3.0、3.7、6.0、6.6、6.9、7.2、9.4、10.5、12后，按1.2.2方法反应后测定荧光发射光谱。

1.2.5 时间对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响 pH为6.0的赖氨酸MDA反应体系分别按按1.2.2方法反应0.5、1、1.5、2、3h后测定荧光发射光谱。1.2.6 浓度对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响 pH为6.0的赖氨酸MDA反应体系，赖氨酸浓度为0.01mmol/L时，MDA浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L；赖氨酸浓度为0.01mmol/L时，MDA浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L；按1.2.2方法反应2h后，测定荧光发射光谱。

1.2.7 不同种类氨基酸与MDA反应的体系荧光发射光谱 二十种氨基酸，按氨基酸浓度为0.05mmol/L、MDA浓度为0.05mmol/L配制反应液；采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节反应液的pH为6，按1.2.2方法反应2h后测定荧光发射光谱。

1.2.8 色氨酸MDA反应体系的荧光发射光谱 按色氨酸浓度为0.05mmol/L、MDA浓度为0.05mmol/L配制反应液；采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节反应液的pH为6，按1.2.2方法反应5、7、15、24、48h后测定同步荧光光谱。

1.3 实验数据处理方法

采用Matlab 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 赖氨酸MDA反应体系的激发光谱与发射光谱

对赖氨酸MDA体系反应1h后按1.2.2方法扫描激发光谱与发射光谱，结果可以发现，赖氨酸MDA体系在400nm波长处有最大吸收，在461nm波长处有最大发射，而赖氨酸、丙二醛在该处均不出峰，说明赖氨酸MDA体系反应产生了新物质。该物质的荧光特征和邓燕等人的研究结果一致[7]，说明该物质可能是类脂褐质。为研究方便，后续研究均是对反应体系的发射光谱开展（Ex.400nm）探讨。

图1 赖氨酸MDA反应体系的激发光谱和与发射光谱Fig.1 The excited and emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.2 pH对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响

pH对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响如图2所示。由图2可以看出，pH为1.8时，赖氨酸MDA反应体系的荧光强度最低，随着pH由低到高，赖氨酸MDA反应体系荧光强度先升高，在pH为6.0时为最大，然后降低。这说明，偏中性的反应体系有利于赖氨酸与MDA反应，这与贺洪的研究结果一致[5]。后续研究过程中反应体系pH选为6.0。

图2 pH对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响Fig.2 Effectof pH on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.3 反应时间对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响

赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱随时间变化的结果如图3所示。由图3可以看出，随着反应时间的延长，赖氨酸MDA反应体系的在461nm处的荧光强度越来越大。这说明产生的荧光物质越来越多。后续研究的反应时间定为2h。

图3 反应时间对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响Fig.3 Effectof reaction time on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.4 浓度对赖氨酸MDA反应体系荧光发射光谱的影响

赖氨酸与MDA浓度比例发生变化时，其荧光产物的量也发生变化，结果如图4所示。由图4可以看出，当赖氨酸浓度固定为0.01mmol/L时，随着丙二醛浓度从0.01mmol/L升高到0.05mmol/L时，反应体系的荧光强度升高；而当赖氨酸浓度固定为0.05mmol/L时，随着丙二醛浓度从0.01mmol/L升高到0.05mmol/L时，反应体系的荧光强度升高，但最终的荧光强度比较小；这说明，反应体系中，丙二醛浓度越高于赖氨酸浓度时，荧光强度越高。已有文献表明：一定条件下高浓度的MDA能够形成乙醛，两分子MDA和一分子乙醛能与带初级氨的化合物反应生成二羟吡啶加成物[9-10]，这与本实验结果一致。

图4 赖氨酸与MDA浓度比对反应体系荧光发射光谱的影响Fig.4 Effectof concentration on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system

2.5 酸性侧链和碱性侧链与MDA反应的荧光发射光谱

为研究氨基酸种类与丙二醛反应的荧光特征，首先分别对酸性侧链氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺），碱性侧链氨基酸（组氨酸、赖氨酸、精氨酸）与MDA体系的荧光发射光谱进行扫描，结果如图5所示。

图5 酸性侧链和碱性侧链氨基酸与MDA反应的荧光发射光谱Fig.5 The emission fluorescence spectroscopy of lacid or basic chain AA-MDA system

由图5可以看出，精氨酸与MDA反应体系的荧光强度最高，赖氨酸次之、组氨酸第三、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺相差不大。对于酸性和碱性侧链来说，氨基酸易于电离，易于发生反应。其中，精氨酸的氨基、亚氨基最有利于反应，荧光强度最高。赖氨酸、组氨酸也是同样道理[11]。

2.6 短小侧链氨基酸与MDA反应的荧光发射光谱

对苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、甘氨酸与MDA反应体系的荧光发射光谱进行扫描，结果如图6所示。由图6可以看出，甘氨酸与MDA反应体系的荧光强度最高，丝氨酸的次之、苏氨酸的第三、丙氨酸的最小。这与甘氨酸的结构有关，在甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸四种氨基酸中，甘氨酸其空间位阻最小，反应最易进行，反应体系的荧光强度最大[11]。

图6 短小侧链氨基酸与MDA反应的荧光发射光谱Fig.6 The emission fluorescence spectroscopy of little side chain AA-MDA system

2.7 长大侧链氨基酸与MDA反应的荧光发射光谱

对色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸与MDA反应体系的荧光发射光谱进行扫描，结果如图7所示。由图7可以看出，苯丙氨酸与MDA反应体系的荧光强度最高，甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸相差较小、酪氨酸的反应峰微小，色氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸不能与MDA反应产生。这与长大侧链氨基酸的结构有关，侧链长大导致空间位阻大，反应难于进行，反应体系的荧光强度就越小。另外，脯氨酸和羟脯氨酸没有单独的氨基，故反应难于进行[11]。

图7 长大侧链氨基酸与MDA反应的荧光发射光谱Fig.7 The emission fluorescence spectroscopy of long side chain AA-MDA system

对不同反应时间的色氨酸MDA体系的同步荧光光谱进行扫描，结果如图8所示。由图8可以看出，随反应时间的延长，色氨酸荧光强度逐渐降低，未发现新的荧光峰出现。说明MDA对色氨酸具有荧光猝灭作用，二者未产生新的荧光物质。这可能是色氨酸的吲哚环结构抑制了其与MDA的反应。

图8 色氨酸与MDA反应体系的同步荧光光谱Fig.8 The synchronouns fluorescence spectroscopy of tryptophan-MDA system

3 结论

赖氨酸与丙二醛反应生成400nm激发、460nm发射的荧光物质，该反应在中性条件下易于进行，并且随时间延长荧光产物增多；反应体系中，丙二醛浓度高于赖氨酸浓度有利于生成荧光产物。不同氨基酸与丙二醛反应产物的荧光强度差异明显，精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等五种氨基酸易与丙二醛反应，而脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸未能与丙二醛反应生成荧光物质。

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Fluorescence spectroscopy of the reaction system between am ino acid and malondialdehyde

SUN Yan-hui，MENG Jin-xiu，JIA Xiao-li，PENG M an-li
（School of Bio&Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239012，China）

The reac tion between am ino acid and malondialdehyde（MDA）was stud ied by fluorescence spectroscopy.The effec t of time，pH and concentration on the em ission spectroscopy of lysine-MDA system was researched，and the reaction charactertic of 19 kinds of am ino acid w ith MDA was compared.The result showed the p roduct of AA-MDA system had Ex.400nm and Em.460nm，easier to happen under the neutral cond ition，w ith the reaction time p rolonged，the fluorescence p roduct inc reased.The concentration of MDA was much more than that of lysine，more fluorescence p roduct increasing.The fluorescence intensity had significant d ifference among kinds of AA-MDA.Arginine，lysine，histidine and g lycine could easier react w ith MDA to p roduce fluorescence p roduct，while p roline，hyd roxyp roline and tryp tophan could not.

lysine；malond ialdehyde；am ino acid；fluorescence spectroscopy

TS201.2

A

1002-0306（2012）22-0042-04

2012－08－28

孙艳辉（1978-），男，博士，副教授，研究方向：食品质量安全。

国家自然科学基金项目（30901129）；安徽省农产品质量与安全特色专业基金项目（20101032）。