长裙竹荪和棘托竹荪的抑菌作用及其化学成分研究

罗盛莲，游 霞，丁聪聪，李 珍，林国秀，于志伟，张 杰

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064)

长裙竹荪和棘托竹荪的抑菌作用及其化学成分研究

罗盛莲，游 霞，丁聪聪，李 珍，林国秀，于志伟，张 杰*

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064)

对长裙竹荪和棘托竹荪乙酸乙酯浸膏水溶液采用滤纸片扩散法进行抑菌作用的研究，并应用气相色谱－质谱联用(GC－MS)对其化学成分进行分析。结果表明:长裙竹荪乙酸乙酯浸膏的水溶液对供试细菌表现出明显抑制作用，但对供试酵母和霉菌抑制作用不明显;棘托竹荪乙酸乙酯浸膏的水溶液对各供试菌均表现出明显抑制作用。两种竹荪水溶液均对高温高压稳定。GC－MS分析表明，长裙竹荪和棘托竹荪乙酸乙酯浸膏水溶液的主要成分是脂肪酸及其酯类、烯烃、邻苯二甲酸酯类、酚类和酮类。

长裙竹荪，棘托竹荪，抑菌作用，化学成分

竹荪，也称竹参、竹菌、竹笙，是一类营养丰富的大型野生食用真菌，隶属于担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属。竹荪作为名贵的食用菌，历史上列为“宫廷贡品”，近代作为国宴名菜，而且也是医学上的新秀，亦是食疗佳品，素有“山珍之王”、“菌中皇后”的美称［1］。我国有红托竹荪、黄裙竹荪、朱红竹荪、长裙竹荪、短裙竹荪、皱盖竹荪和棘托竹荪7个种［2］。目前用于人工栽培的竹荪有长裙竹荪、短裙竹荪、红托竹荪和棘托竹荪。竹荪在治疗高血压、精神衰弱和肠胃疾病等方面具有显著效果，而且能防癌抗癌［3］。特别的是，竹荪还具有特异的防腐功能，在炎热的夏季做菜煲汤时，置少许竹荪入内，可防止酸败，并延长存放时间［4］。据报道，我国每年由于微生物污染造成的粮食食品腐败现象十分严重，这不仅对人类健康产生威胁，而且造成严重的经济损失。目前用于防止食品腐败变质的重要手段是添加化学合成防腐剂和天然防腐剂［5］。但是随着科学技术的进步，人们逐步发现化学合成食品防腐剂对人体健康存在潜在威胁。因此，开发更安全、更方便使用的天然防腐剂［6］成为了食品防腐剂发展的新趋势。鉴于竹荪对食物的防腐效果，选取目前种植最广的长裙竹荪和棘托竹荪作为实验对象，研究其对8种常见的致病致腐菌的抑制作用，并对两种竹荪的抑菌成分进行初步分析，为进一步开发利用竹荪成为天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长裙竹荪和棘托竹荪子实体干品 市售，粉碎后过80目筛;乙酸乙酯 分析纯，成都科亚公司; R－200旋转蒸发仪、岛津 2010－plus气质联用仪 BUCHZ公司;大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella coli)、假丝酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黄 曲 霉 (Aspergillusflavus)、青 霉(Penicillium sp.) 四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室提供;LB培养基、马铃薯培养基(PDA) 广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物的制备 分别取长裙竹荪和棘托竹荪干子实体粉末10g，按照料液比1∶10加入乙酸乙酯，混匀后置于水浴中80℃回流抽提8h，过滤，所得滤渣再加入70mL乙酸乙酯，按原条件进行抽提，过滤，弃滤渣，合并两次滤液，减压浓缩至恒重。基于之前实验，浸膏选用无菌水溶解，浸膏分别加入10mL无菌水溶解，即得长裙竹荪和棘托竹荪乙酸乙酯浸膏的水溶液(以下简称提取物)，质量浓度为1g/mL(相当于1mL溶液中含有1g原材料)，保存备用。

1.2.2 抑菌实验

1.2.2.1 供试菌株悬浮液的制备 将供试菌种接入相应的试管斜面培养基上进行活化。活化之后，用接种环挑少许菌体于装有5mL液体培养基的试管内，细菌置37℃振荡培养3h，霉菌、酵母菌置25℃振荡培养3h，制成菌体悬浮液。

1.2.2.2 含菌培养基平板的制备 配制好的PDA固体培养基和LB固体培养基，高压灭菌后，冷却至50℃左右。无菌操作下，向干热灭菌的培养皿中加入200μL菌悬液，再倒入适量的培养基混匀，每皿15～20mL［7］。

1.2.2.3 抑菌实验 将直径13mm的小滤纸圆片，于培养皿中160℃干热灭菌1～2h。将灭菌滤纸片贴在

1.2.2.2中制备好的含菌平板上，再往每个圆片上加入30μL提取物，以无菌水做空白对照，每个平皿放3个圆片。接好的平板于4℃放置4h，再置恒温箱中培养，细菌于37℃培养18h，霉菌、酵母菌于25℃培养48h，利用十字交叉法［8］测量抑菌圈直径。

1.2.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 利用LB培养基和竹荪提取物，经试管连续双倍稀释法得竹荪提取物质量浓度分别为 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625g/mL的培养基各10mL，另设不加提取液的培养基为空白对照，121℃灭菌15min。趁热倒入已灭菌的培养皿中，冷却后在每一浓度培养基上划线接种供试菌，每个浓度三个平行。细菌置37℃下培养18h，真菌置25℃下培养48h，观察生长情况，以平板中没有菌体生长的最低浓度即为提取物的最低抑菌浓度MIC。

1.2.2.5 稳定性研究 将长裙竹荪和棘托竹荪提取物在121℃下高压灭菌15min，以枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄曲霉为代表，按照1.2.2.3方法测定抑菌圈，以未处理的提取物为对照。

1.2.3 化学成分的分离与鉴定

1.2.3.1 气相色谱条件 色谱柱:FFAP极性柱(30m ×0.32mm×0.25μm);进样口温度为250℃，检测器温度 280℃;采用程序升温:70℃保持 3min，以5℃/min升至 100℃，保持 6min，以 5℃/min升至150℃，保持 6min，以 7℃/min升至 220℃，保持15min;柱流量 2.0mL/min，柱头压 5.5Psi，进样量0.5μL;分流比30∶1。

1.2.3.2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源;电子能量70Ev;溶剂延迟时间6min;分子量范围50～450amu。

2 结果与分析

2.1 提取物的抑菌效果

长裙竹荪乙酸乙酯浸膏为浅黄色油状粘稠液体。由表1知，长裙竹荪提取物对两类革兰氏细菌均有明显抑制作用，而且革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)比革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)更敏感;但对酵母和霉菌无明显抑制作用。

棘托竹荪乙酸乙酯浸膏为深黄色油状粘稠液体。由表1知，棘托竹荪提取物对各种供试细菌、真菌均有不同程度的抑制作用，其中酵母更敏感。

表1 长裙竹荪和棘托竹荪提取物的抑菌实验结果Table 1 Antimicrobial activities of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

2.2 最低抑菌浓度(MIC)

从表2知，长裙竹荪提取物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌的MIC为0.05g/mL，对枯草芽孢杆菌的MIC为0.025g/mL，对大肠杆菌的MIC为0.1g/mL。抑菌结果显示长裙竹荪提取物对真菌无明显抑制作用，故不讨论其对真菌的MIC。

棘托竹荪提取物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄曲霉、桔青霉的MIC为0.05g/mL，对大肠杆菌的MIC为0.1g/mL。

2.2 稳定性分析

由表3知，经高温高压处理后，长裙竹荪和棘托竹荪提取物对枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄曲霉的抑制效果变化不大，表明两种提取物中的有效成分对高温、高压稳定，故而由此获得的防腐剂性质稳定。

2.3 提取物的化学成分鉴定

实验对两种竹荪的抑菌成分进行了初步分析。

通过GC－MS技术分离和鉴定，长裙竹荪提取物共鉴定出37种化学成分(表4)，占提取物总量的82.98%，主要是脂肪酸酯类 (41.27%)、烯烃(14.68%)、酮类(12.56%)、醛类(5.78%)、邻苯二甲酸酯类(4.37%)、醇类(1.26%)、酚类(1.23%)、烷烃(1.01%)和酰胺类(0.82%)等。其中(－)－异长叶烯－9－酮(10.73%)、苯乙醛(3.56%)、邻苯二甲酸二异丁酯(2.59%)、棕榈酸甲酯(4.88%)、2－氧－棕榈酸甲酯(2.71%)、油酸甲酯(19.66%)、亚油酸甲酯(3.11%)和Z－9－十六烷基花生酸酯(4.26%)是主要成分。

表2 长裙竹荪和棘托竹荪提取物对各种受试菌的MIC测定结果Table 2 MICs of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

表3 长裙竹荪和棘托竹荪提取物的稳定性分析Table 3 Stability analysis of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

通过GC－MS技术分离和鉴定，棘托竹荪提取物共鉴定出21种化学成分(表4)，占提取物总量的84.83%，主要是脂肪酸及其酯类(25.85%)、邻苯二甲酸酯类(19.01%)、酚类(18.18%)、酮类(8.67%)、烯烃(5.62%)、醛类(3.11%)、有机酸类(2.26%)、烷烃(1.16%)和醇类(0.97%)等。其中氧杂环十三烷－2－酮(6.02%)、(－)－异长叶烯－9－酮(2.65%)、苯乙醛(3.11%)、α－芹子烯(4.44%)、2，6－二甲基对苯二酚(18.18%)、邻苯二甲酸二异丁酯(14.12%)、邻苯二甲酸二丁酯(4.89%)、7，10－十八碳二烯酸甲酯(4.49%)、棕榈酸甲酯(8.34%)、油酸甲酯(6.17%)、硬脂酸甲酯(2.18%)、2－羧甲基－3－甲基－环戊甲酸(1.19%)和葵二酸(1.07%)是主要成分。

上述结果表明，相同浓度的长裙竹荪和棘托竹荪提取物有11种相同成分，主要是酯类、酮类、酚类和醛类化合物。经大量实验证明，各种酚类、脂肪酸酯类化合物均对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑制作用［9］，这可能是两种提取物在抑制细菌方面表现出一致性的主要原因。而各成分的含量差异较大，酚类、邻苯二甲酸酯类在棘托竹荪提取物中的含量分别为18.18%、19.01%，远高于在长裙竹荪提取物中的含量(分别为1.23%、4.37%)，可能引起两者在抑制真菌活性方面产生差异。据报道，酚类物质的抑菌作用不仅限于细菌，对于酵母和霉菌也有效果［10］。陈敏［11］对链霉菌6803菌株产生的化感物质进行抑菌研究，结果表明邻苯二甲酸二异丁酯和邻苯二甲酸二丁酯能有效抑制荔枝炭疽病和小麦赤霉病。其中哪些成分抑菌效果较好，是否具有协同、加成或拮抗作用，还有待于进一步研究。

3 结论

如今尚未有比较长裙竹荪和棘托竹荪抑菌作用及其化学成分的报道，本实验对两种竹荪进行了对比研究，结果表明长裙竹荪提取物对细菌抑制效果明显，对酵母菌和霉菌基本无抑制作用，与谭敬军等［12］实验结果一致。棘托竹荪提取物对三类受试菌均有不同程度的抑菌作用，与檀东飞等［13］实验结果一致。MIC测定结果表明，长裙竹荪和棘托竹荪提取物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌的MIC均为0.05g/mL，对大肠杆菌的MIC均为0.1g/mL，而长裙竹荪提取物对枯草芽孢杆菌的MIC为0.025g/mL，棘托竹荪提取物对枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄曲霉、桔青霉的MIC为0.05g/mL。稳定性分析表明两种竹荪提取物都能耐高温高压，可应用于食品中。通过GC－MS分析，长裙竹荪和棘托竹荪提取物的主要成分均为酯类、酮类、酚类和醛类化合物，可能是两种提取物对供试细菌产生明显抑制作用的原因，而棘托竹荪提取物中酚类和邻苯二甲酸酯类的含量远高于长裙竹荪提取物，可能是酵母和霉菌对棘托竹荪提取物更敏感的原因。

上述实验结果表明，长裙竹荪和棘托竹荪均含有天然抑菌成分，但由于竹荪提取物中成分比较复杂，需要对其子实体的抑菌成分和抑菌机理进行进一步分析，为新型防腐剂的研究开发开辟一条新的道路。

表4 长裙竹荪和棘托竹荪提取物的GC－MS分析Table 4 Results of GC－MS analysis

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Antimicrobial activities and chemical compositions of Dictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvata

LUO Sheng－lian，YOU Xia，DING Cong－cong，LI Zhen，LIN Guo－xiu，YU Zhi－wei，ZHANG Jie*
(Key Laboratory of Bio－resource and Ecological Environment，Ministry of Education，Life Science College of Sichuan University，Chengdu 610064，China)

Antimicrobial activities and chemical compositions of water extracts of ethyl acetate extracts ofDictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvatawere studied.The filtering paper method was applied to the antimicrobial activity test.The chemical compositions of the extracts had been researched by Gas Chromatography－Mass Spectrometry(GC－MS).The results showed that the extract ofDictyophora indusia fisscherhad strong antimicrobial effects on bacteria but weak on yeast and mold.The extract ofDictyophora echinovolvatahad strong antimicrobial activity to mold，yeast and bacteria tested.Meanwhile，the antimicrobial activities under high temperature and strong pressure were stable.GC－MS analysis indicated that the major compositions of the extracts were fatty acids，olefins，phthalates，phenols and ketones.

Dictyophora indusia fisscher;Dictyophora echinovolvata;antimicrobial activity;chemical composition

TS202.3

A

1002－0306(2012)21－0070－04

2012－04－12 *通讯联系人

罗盛莲(1988－)，女，硕士研究生在读，研究方向:食品研究与开发。

国家高技术研究发展计划(863计划)(2007AA021506)。