LC-MS/MS法测定浓缩果汁中2-氨基苯并咪唑、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵的残留量

黄文雯，刘晓松，郑 玲，宁恩创

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004；

2.广西出入境检验检疫局技术中心，广西南宁 530021）

LC-MS/MS法测定浓缩果汁中2-氨基苯并咪唑、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵的残留量

黄文雯1，刘晓松2，*，郑 玲2，宁恩创1

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004；

2.广西出入境检验检疫局技术中心，广西南宁 530021）

建立了同时测定浓缩果汁中2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵的LC-MS/MS检测法。选取苹果、芒果、菠萝、梨、橙、荔枝、西番莲7种浓缩果汁进行了研究，样品采用乙腈提取，经PSA（乙二胺基N-丙基柱）柱净化后用LC-MS/MS测定。色谱条件是以甲醇-10mmol/L的乙酸铵（含0.1%体积浓度的甲酸）为流动相进行梯度洗脱，待测物经ZORBAX Eclipse XDB-C18柱分离，最后用电喷雾正离子（ESI+）和多反应监测模式（MRM）进行MS测定。结果表明，当2-氨基苯并咪唑添加水平为2、4、20μg/kg，噻菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵添加水平为1、2、10μg/kg时，回收率为70.3%～109.8%，相对标准偏差为0.1%～10.9%，方法的检出限：2-氨基苯并咪唑2μg/kg、多菌灵1μg/kg、噻菌灵1μg/kg、甲基硫菌灵1μg/kg。该方法能有效检测出浓缩果汁中四种杀菌剂的残留量，且稳定性好，结果可靠，为监控浓缩果汁的质量安全提供了一个行之有效的途径。

LC-MS/MS，浓缩果汁，2-氨基苯并咪唑，噻菌灵，多菌灵，甲基硫菌灵

苯并咪唑类杀菌剂有高效、广谱的内吸性，被广泛应用各个领域[1-3]。在水果中常用的类型有苯菌灵、2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵，其性质与作用各不相同：苯菌灵能防治水果的真菌病害、螨类等，稳定性差，易转化为多菌灵，过量的苯菌灵会引起哺乳动物染色体及肝细胞的微管骨架发现变化[3]，抵制蛋白合成[4]及脂质过氧化作用[5]；多菌灵能有效抑制病原菌的繁殖、生长[6]，但残效期长，在植物体内易富集，并对人产生潜在性危害[7-8]；甲基硫菌灵对真菌的防治效果显著，广泛应用于重要作物[9]，在植物体内可代谢转换为多菌灵[10]；噻菌灵主要应用于果蔬的防腐，是一种会使小鼠肾致畸与发生毒副作用的物质[11-12]；2-氨基苯并咪唑具有强杀菌、抗菌能力[13]，但由于其难分解从而对环境造成威胁。基于这些杀菌剂的危害性，美国、日本等国家现已严格控制食品中苯菌灵、2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵的残留量。我国也已将监测食品苯并咪唑类杀菌剂的残留量列为我国食品质量安全检测中的重要项目。浓缩果汁是水果重要的纵向加工产品，有些果汁在生产过程中一般不削皮或去核，杀菌剂易残留于其中。目前国内外对水果中杀菌剂的检测方法主要有：HPLC法[14-17]、LC-MS/MS法[18-20]等。这些方法主要是检测水果及其新产品中多种农药的残留，针对检测浓缩果汁中苯并咪唑类杀菌剂的研究较少，且均未能同时检测浓缩果汁中2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵的残留。鉴于此，为有效监控浓缩果汁的质量安全，便于国内各检验机构的日常检测及各浓缩果汁生产厂的产品质量控制，本文对建立一种简单有效、准确可靠且能同时检测这四种杀菌剂的方法进行了尝试和探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果、菠萝、荔枝、芒果、橙子、西番莲、梨 7种浓缩果汁；标准品 2-氨基苯并咪唑 Dr.Ehrenstorfer，德国；多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵 Sigma-Aldrich，德国；四种标准品纯度均大于97%；乙腈、甲苯、乙酸铵、甲醇、甲酸 HPLC级，TEDIA Company，美国；磷酸氢二钠 AR级，汕头市西陇化工厂；氯化钠 AR级，成都市科龙化工试剂厂；PSA柱 3mL，500mg，CNW Technologies GmbH，德国。

RRLC1200+6410B液相-串联质谱联用仪 美国Agilent；KQ5200E超声波器 昆山市超声仪器有限公司；L-420台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；VOTEX GENIE2，SIENTIFIC INDUSTRIES涡旋振荡器 美国；YAMATO-SA300，YAMATO SCIENTIFIC CO.LTD振荡器 日本；JULBAO FP40-MC真空旋转蒸发仪 德国优莱博技术有限公司；Milli-Reference超纯水器 美国Millipore公司；3-16PK高速离心机德国Sigma；KL512氮吹仪 北京康林科技有限公司；PHS-3C pH计 上海精科仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 单标准溶液的配制：分别用分析天平称取0.010g的标准品，用甲醇配制成浓度为100μg/mL的单标准溶液，于－18℃下避光保存。

4种杀菌剂的混合标准溶液的配制：用4种单标标准溶液配制成0.2μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.4μg/mL），0.04μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.08μg/mL）、0.02μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.04μg/mL）3种浓度混合标准溶液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDBC18柱（Agilent，美国）：4.6mm×50mm，粒径为1.8μm；流动相：缓冲盐溶液（0.1%甲酸-10mmol/L乙酸铵，A）和甲醇（B）梯度洗脱；洗脱程序：编制洗脱曲线，起始状态为90%A，在0～7min，使A相降至20%，保持2min；之后用1min使B相升至100%，保持4min；接着将A相升至90%，保持5min后回复起始状态；流速：0.4mL/min；进样体积：10μL；柱温：40℃。

1.2.3 质谱条件 离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：4000V；雾化气温度：350℃；雾化气流量：12L/min；雾化气压力（氮气）：40PSI。

1.2.4 样品提取 样品提取：称浓缩果汁样2g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入0.2mol/mL的Na2HPO4缓冲溶液10mL，3g氯化钠混匀，用2mol/L的NaOH溶液调pH至8.5～8.6，加入10mL乙腈振荡提取15min，8000r/min条件下离心10min，取上清液，重复提取操作一次，合并上清液并定容至20mL。取10mL的上清液到100mL的鸡心瓶中，40℃真空旋转浓缩至1.5～2mL，待净化。

1.2.5 净化 在PSA柱中加入1g（精确到0.01g）无水硫酸钠，用4mL乙腈-甲苯溶液（3∶1，V∶V）活化柱子，待液面到达固体面时，迅速将浓缩液上柱，并用1mL的乙腈-甲苯溶液（3∶1，V∶V）洗涤鸡心瓶并过柱，重复此操作3次，最后用15mL乙腈-甲苯溶液（3∶1，V∶V）洗脱，收集全部的柱流出液于100mL鸡心瓶中，旋转蒸发至1.5～2mL，转移至15mL的离心管中，并用3mL的乙腈-甲苯溶液（3∶1，V∶V）洗涤鸡心瓶2次，合并洗涤液到15mL离心管中，40℃水浴下氮气吹干，用流动相定容并超声3～5min，混匀，过0.22μm有机相滤膜，LC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 色谱及质谱条件的确定

分别配制1μg/mL的2-氨基苯并咪唑、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵标准溶液，选择ESI+作为电离模式，对雾化气温度、雾化气流量、源内碎裂电压及碰撞能量等条件进行优化。通过MS2扫描方式得到分子离子峰，并优化得到源内碎裂电压，再在Product Ion模式下优化碰撞能量，并得到定量和辅助定性离子，然后用优化得到的质谱条件进行MRM测定。经反复测试、优化，得到4种杀菌剂的质谱条件如表1所示。

表1 各杀菌剂的质谱条件Table 1 Values of the instrumental settings optimized for each pesticide

比较以甲醇、甲醇∶水=1∶1（V∶V）、甲醇∶乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）=1∶9（V∶V）作为定容体系时，各杀菌剂的影响可知，以甲醇作为定容体系时，2-氨基苯并咪唑的峰有拖尾现象，且各峰宽过宽；以甲醇∶水=1∶1（V∶V）作为定容体系时，响应值均不错，但各峰形效果依旧不太好。以甲醇∶乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）=1∶9（V∶V）作为定容体系时，各离子峰的峰形好，响应值高，分离效果也很好。为此，选择甲醇：乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）=1∶9（V∶V）作为方法的定容体系。利用已确定的定容体系及色谱条件可得0.02mg/mL的4种混合标准溶液（含2-氨基苯并咪唑0.04mg/mL）的总离子图与各杀菌剂对应的定性与定量离子如图1、图2所示。

图1 4种杀菌剂混合标准溶液质谱总离子流图Fig.1 Mass spectrum of standard mixture of the 4 pesticides

图2 4种杀菌剂的定性与定量离子图Fig.2 The ions for the identification and quantitation of the 4 pesticides

2.2 样品前处理条件的选择

2.2.1 提取条件的选择 由于浓缩果汁的酸度均较高，经实验发现在酸度过高的情况下乙腈不能充分提取这4种杀菌剂，为此，需对样液的pH进行调节。当样品溶液调为pH9、pH10、pH12时发现：当pH9～10条件下，甲基硫菌灵没有出峰；当pH12时，只有多菌灵、噻菌灵出峰；当样品溶液调为pH7、pH8、pH9时，4种杀菌剂均出峰，但pH7时，甲基硫菌灵的提取效果较好，但2-氨基苯并咪唑的提取效果较差；当pH8、pH9时，4种杀菌剂均出峰，但2-氨基苯并咪唑和甲基硫菌灵的提取仍不够。当把样液调至pH8、pH8.2、pH8.4、pH8.6、pH8.8、pH9时发现：低于pH8.5～8.6时，2-氨基苯并咪唑的响应值开始下降，高于pH8.5～8.6时，甲基硫菌灵的响应值开始下降。所以综合提取样液的pH对各杀菌剂的影响，最终选择提取样液的pH为8.5～8.6。

2.2.2 样品净化条件与浓缩条件的确定 通过实验比较与分析MCX柱、NH2柱、C18柱、NH2柱+活性碳柱、PSA柱这几种柱子对样品的净化效果。结果表明，用MCX柱净化2-氨基苯并咪唑的回收率差；用C18柱净化，进行LC-MS/MS测定时受杂质干扰大，且4种杀菌剂的回收率均低；用NH2柱净化，由于NH2柱对2－氨基苯并咪唑的强吸附力，导致其难以洗脱下来；用NH2柱+活性碳柱净化，由于活性碳柱对2-氨基苯并咪唑的强吸附致使其回收率很低；用PSA柱净化，基于PSA柱的极性比NH2柱弱，对2－氨基苯并咪唑的吸附力相对较弱，使其洗脱效果显著，保证了这四种化合物的回收率且稳定，所以净化柱选用PSA柱。

提取样液浓缩越干，2-氨基苯并咪唑的回收率下降越严重，其他三种杀菌剂的回收率不稳定，实验证明浓缩量控制在1.5～2mL时，则能保证各杀菌剂的回收率稳定且效果较好。同时经实验表明，过柱净化后，若直接旋转浓缩近干后定容进样，2-氨基苯并咪唑的回收率差，只有40%左右；旋至1～1.5mL，转移到15mL离心管中再氮吹至干定容进样，回收率则相对较好。

2.3 基质效应、线性相关性、回收率、精密度、检出限

基质效应：为避免由于浓缩果汁中某些成分产生的抑制或增益效应而使得样品回收率有所偏差，进行基质效应的研究。通过表2可以看出，这7种浓缩果汁对这四种化合物都有一定的基质效应，所以为保证测定结果可靠，需进行基质加标实验。

线性相关性、检出限：准确称取2g（精确至0.01g）样品，按1.2.4和1.2.5方法进行处理，获取基质溶液为溶剂，配制系列标准溶液：0.1μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.2μg/mL），0.04μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.08μg/mL），0.02μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.04μg/mL），0.01μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.02μg/mL），0.001μg/mL（含2-氨基苯并咪唑0.002μg/mL），以所得响应值（峰面积）Y与浓度X进行回归分析，得到2-氨基苯并咪唑的回归曲线为Y=2652.0X-3816.2，线性相关系数

表2 7种浓缩果汁的基质效应结果Table 2 Matrix effect of the 7 kinds of concentrated fruit juice

表3 7种浓缩果汁试样的加标回收实验（n=6）Table 3 Recovery values and relative standard deviations of the four target pesticides in 7 kinds of concentrated fruit juice（n=6）

为0.9996；多菌灵的回归曲线为Y=9718.4X-7284.4，线性相关系数为0.9985；噻菌灵的回归曲线Y=7787.8X-3610.1，线性相关系数为0.9989；甲基硫菌灵的回归曲线为Y=5589.3X-778.39，线性相关系数为0.9999，表明四种杀菌剂的线性关系良好。以噪音信号的10倍确定方法的定量下限，结合样品的称样量和最终定容体积，这4种杀菌剂在苹果、芒果、菠萝、梨、橙、荔枝、西番莲这7种浓缩果汁中的检出限为：2-氨基苯并咪唑2μg/kg、多菌灵1μg/kg、噻菌灵1μg/kg、甲基硫菌灵1μg/kg。

回收率、精密度：通过表3，可得出这7个样品的加标回收率在70.3%～109.8%之间，相对标准偏差0.1%～10.9%。这表明用该方法测定浓缩果汁里的这四种杀菌剂残留量可行且稳定性好。

2.4 实际样品的检测

检测市场上橙子、荔枝、苹果、西番莲、梨汁、菠萝、芒果浓缩果汁样品。检测苹果样7个，其中检出2-氨基苯并咪唑残留浓度为1.8～25.7μg/kg，多菌灵1.3～20.2μg/kg；荔枝3个，其中检出多菌灵残留浓度为1.3～20.2μg/kg；菠萝3个，其检出2-氨基苯并咪唑残留浓度1.1μg/kg，多菌灵为1～1.4μg/kg；橙子1个，检出多菌灵残留浓度为1.2μg/kg。以上所检出的残留量，均低于国际组织及我国规定的最大残留限量值，说明近年

来我国在农药使用的监督管理上取得了较大的成绩。在西番莲、梨、芒果汁样中则均未检出这4种农药，可能与不同品种水果种植时所选择的农药有关；另一方面，从化学性质上分析，在一定的条件下，苯菌灵和甲基硫菌灵均可部分代谢转化成多菌灵和2-氨基苯并咪唑（2-AB），可能也是出现这种结果的原因。

3 结论

本文建立了同时检测浓缩果汁中2-氨基苯并咪唑、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵四种常见杀菌剂的LC-MS/MS方法。通过进行各种浓缩果汁加标回收实验，进行各浓缩果汁的基质效应实验，获得方法的回收率在70.3%～109.8%之间，相对标准偏差在0.1%～10.9%之间，最低检出限分别为：2-氨基苯并咪唑2μg/kg、多菌灵1μg/kg、噻菌灵1μg/kg、甲基硫菌灵1μg/kg。该方法能有效检测出浓缩果汁中四种杀菌剂的残留量，且简单、快速、稳定性好，为监控我国浓缩果汁的质量安全提供了一个行之有效的途径。

[1]李红霞，陆悦健，周明国.苯并咪唑类杀菌剂的研究进展[J].中国植物病害化学防治研究，2002，3：24-32.

[2]朱蓓蕾，蒋金书.动物源食品药物残留[M].上海：上海科学技术出版社，1994：56.

[3]Urani C， Chiesara E， Galvani P， et al.Camatini，Benomyl affects the microtubule cytoskeleton and the glutathione level of mammalian primary cultured hepatocytes[J].Toxicol Lett，1995，76：135-144.

[4]Marinovich M，Ghilardi F，Galli C L.Effect of pesticide mixtures on in vitro nervous cells：comparison with single pesticides[J].Toxicology，1996，108：206-301.

[5]Banks D，Soliman M R.Protective effects of antioxidants againstbenomylinduced lipid peroxidation and glutathione depletion in rats[J].Toxicology，1997，116：177-181.

[6]World Health Organisation.Environmental Health Criteria 149.Geneva，1993：1-125.

[7]M J G de la Huebra， Nieto P H O， Ballestero Y， et al.Determination of carbendazim in soil samples by anodic stripping voltammetry using a carbon fiber ultramicroelectrode，Fresenius[J].Anal Chem，2002，367：474-478.

[8]Jones S E， Williams D J， Holliman P J， et al.Rodrigues，Ring-testing and field validation of a terrestrial model ecosystem（TEM）-an instrument for testing potentially harmful substances：fate of the model chemical carbendazim[J].Ecotoxicology，2004，13：29-42.

[9]Canton J H.The toxicity of benomyl， thiophanate-methyl，and BCM to four freshwater organisms[J].Bull Environ Contam Toxicol，16：214-218.

[10]Traina M E， Fazzi P， Macrì C， et al.In vivo studies on possible adverse effects on reproduction of the fungicide methyl thiophanate[J].Appl Toxicol，18：241-248.

[11]Ogata A，Ando H，Kubo Y，et al.Teratogenicity of thiabendazole in ICR mice[J].Food Chem Toxicol，1984，22：509-520.

[12]Mizutani T，Ito K，Nomura H，et al.Nephrotoxicity of thiabendazole in mice depleted of glutathione by treatment with DL-buthionine sulphoximine[J].Food Chem Toxicol，1990，28：169-177.

[13]陈兴权，赵天生.2-氨基苯并咪唑的合成[J].精细石油化工，2004（1）：45-46.

[14]饶钦雄，曲明清，赵晓燕，等.HPLC法测定常见蔬菜水果中多菌灵、噻菌灵和苯菌灵残留量[J].上海农业学报，2009，25（4）：85-88.

[15]陈莹，丛佩华，聂继云，等.分散固相萃取-高效液相色谱法测定水果中多菌灵和噻菌灵[J].果树学报，2008，25（5）：769-773.

[16]李海飞，李静，徐国锋，等.高效液相色谱快速测定水果中的3种苯并咪唑类杀菌剂[J].现代农业科技，2009（1）：114-116.

[17]刘晓松，童张法，郑玲，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定噻菌灵和多菌灵在浓缩菠萝汁中的残留量[J].分析科学学报，2007，23（3）：311-314.

[18]Kaushik Banerjee，Dasharathp Oulkar，Shubhangib Patil，et al.ADSULE multiresidue setermination and uncertainty analysis of 87 pesticides in mango by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Agric Food Chem，2009，57：4068-4078.

[19]Cristina Blasco，Guillermina Font，Jordi Manes，et al.Solid-Phase microextraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry to determine postharvest fungicides in fruits[J].Anal Chem，2003，75：3606-3615.

[20]Christer Jansson，Tuija Pihlström，Bengt-Göran Österdahl，et al.A new multi-residue method for analysis of pesticide residues in fruit and vegetables using liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography A，2004，1023：93-104.

Determination of 2-aminobenzimidazole，carbendazim，triabendazole，thiophanate-methyl in concentrated fruit juice by LC-MS/MS

HUANG Wen-wen1，LIU Xiao-song2，*，ZHENG Ling2，NING En-chuang1
（1.The light Industry and Food Engineering College of Guangxi University，Nanning 530004，China；
2.Technical center of Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanning 530021，China）

A liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry method was developed for quantitative determination of 2-aminobenzimidazole，carbendazim，triabendazole，thiophanate-methyl in concentrated fruit juice.Apple，mango，pineapple，pear，orange，lychee，passion fruit juice concentrate were selected as samples.The samples were extracted by acetonitrile and purified by PSA column.With methanol-10mmol/L ammonium acetate（containing 0.1%volume concentration of formic acid）as mobile phase gradient elution，extractions of samples were separated by ZORBAX Eclipse XDB-C18column and detected by electrospray tandem mass spectrometry with ESI+and multiple reaction monitoring（MRM）modes.Results showed that the mean recoveries ranged from 70.3%～109.8%with relative standard deviations in the range of 0.1%～10.9%when the spiked concentrations of 2-amino-benzimidazole were 2，4，20μg/kg and thiophene benomyl，carbendazim，thiophanate-methyl were 1，2，10μg/kg respectively.And the limits of detections of 2-amino-benzimidazole，carbendazim，thiabendazole，thiophanate-methyl were 2，1，1，1μg/kg.This method can be used to accurately and efficiently detect these four fungicides residues in concentrated fruit juice so it can be an important measure to monitor and control the quality of concentrated fruit juice.

liquid chromatography-mass-mass spectra characterization；concentrated fruit juices；2-aminobenzimidazole；carbendazim；triabendazole；thiophanate-methyl

TS207.3

A

1002-0306（2012）22-0056-05

2012－05－14 * 通讯联系人

黄文雯（1986－），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

国家质检总局科技计划项目（2010IK164）；广西自然科学基金项目（2010GXNSFA013039）。