酶催化亚麻籽油甘油解制备富含α-亚麻酸的甘油二酯的研究

刘艳丰，黄惠华

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

酶催化亚麻籽油甘油解制备富含α-亚麻酸的甘油二酯的研究

刘艳丰，黄惠华*

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

在无溶剂体系中，以亚麻籽油和甘油为反应底物，Lipozyme 435为催化剂，制备富含α-亚麻酸的甘油二酯，采用单因素实验与响应面分析法考察了制备过程中底物摩尔比、反应时间、加酶量和反应温度对甘油二酯得率的影响。结果表明，反应的最佳条件为底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)=5∶3，加酶量8.8wt%，反应温度为58.3℃，反应时间为9.1h。在此反应条件下反应所得产物中甘油二酯含量约达50.21%，纯化后的甘油二酯的理论纯度可达60.12%，α-亚麻酸的含量达46.41%。

亚麻籽油，α-亚麻酸，甘油二酯，甘油解，酶催化

甘油二酯（diglyceride，简称DG)是天然存在的油脂，在结构上可分为2分子脂肪酸分别结合到甘油的两个端羟基上形成的1，3-甘油二酯和分别结合到甘油中间位的羟基和一端羟基上形成的1，2-甘油二酯2种，是目前广受关注的一种健康食用油，也是多元醇型非离子表面活性剂的一个重要品种，具有乳化、抗静电、润滑等特性，还有安全、营养、加工适应性好、人体相容性高等诸多优点[1]。2000年底，美国食品与药品管理局（FDA)经过安全审查将甘油二酯列入了公认安全性食品。现代社会里，肥胖、高血压、冠心病等富贵病已经成为危害人们身体健康的主要疾病，而高脂肪饮食导致的脂肪在人体内的积累又是这些疾病的主要诱因，因此营养专家警示人们为了保持健康，应极力减少和控制膳食中的油脂含量。各种实验研究表明，人体摄入甘油三酯和DG后两者的代谢方式不同，DG（尤其是1，3DG)往往具有更少的热量且很少转化成脂肪在体内堆积，具有降低内脏脂肪、抑制体重增加、降低血液中中性脂肪量的作用，可用于预防与治疗高脂血症及与高脂血症密切相关的心脑血管疾病，如动脉硬化、冠心病、中风、脑血栓、肥胖、脂肪肝等[2]，引起了人们的广泛关注。亚麻作为世界十大油料作物之一，其产量占第7位[3]，在中国属于传统的油料作物。亚麻籽油是目前n-3脂肪酸含量最高的植物油脂之一，其中α-亚麻酸通常含量高达45% ～65%左右，大量科学研究证实亚麻籽油具有抗炎、降血脂、降胆固醇、降血压、抑制癌症的产生和转移、防治糖尿病以及眼疾等多种生理功能[4]，正常人体需每日平均摄取α-亚麻酸约1.5g，而医学和营养学家根据膳食结构的流行病学调查得出目前人群日摄入量不足世界卫生组织推荐量（1.25g)的50%，即人们普遍缺乏α-亚麻酸[5]。本研究拟采用固定化酶Lipozyme 435在无溶剂体系中催化亚麻籽油甘油解制备富含α-亚麻酸的甘油二酯，通过单因素与响应面法结合考察底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)、加酶量、反应温度、反应时间4个因素对甘油二酯得率的影响，优化反应条件，得到含有大量α-亚麻酸的甘油二酯产品，为具有多功能的保健油脂开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

有机亚麻籽油 河北欣奇典生物科技有限公司，α-亚麻酸≥56%，不饱和脂肪酸≥80%;Lipozyme 435 诺维信（中国)生物技术有限公司，标称活力10000PLU/g;正己烷、异丙醇 天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯;甘油、石油醚、乙醚 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

JA1003电子分析天平 上海上天精密仪器有限公司;XW-80A漩涡混合器 郑州南北仪器设备有限公司;THZ-C气浴恒温振荡器 苏州培英实验设备有限公司;TDL-5-A台式离心机 河南兄弟仪器设备有限公司;UltiMate3000型液相色谱仪 配有日本岛津RI-101 SHODEX示差折光检测器与chromeleon色谱软件，美国戴安公司;WD-9403E紫外分析仪 北京六一仪器厂;Agilent7890A气相色谱仪 配备有分流/不分流进样器和氢火焰离子检测器（FD)的惠普7890气相色谱分析仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶促亚麻籽油甘油解制备甘油二酯 按照摩尔比例精确称取一定量的亚麻籽油与甘油至具塞三角瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme 435，采用漩涡混合器混合后放入温度恒定、转速为200r/min的气浴恒温振荡器中反应一段时间，然后将反应混合物经3000r/min离心2min，取上层油液待测。

1.2.2 HPLC-RID法测定甘油酯组成[6]液相色谱条件为：检测器：RI-101 Shodex示差折光检测器;色谱柱：Luna Silica（2)硅胶色谱柱250×4.60mm;流动相：正己烷/异丙醇为90∶10（V/V);流速：1.0mL/min;柱箱温度：35℃;检测器温度：35℃;进样量：10μL。根据样品中甘油二酯、甘油三酯的色谱峰与亚麻籽油、甘油二酯对照品的保留时间范围及薄层色谱分析鉴定结果来判断甘油酯。某种甘油酯的含量表示为该种甘油酯的峰面积占总的甘油酯峰面积的百分比。

1.2.3 反应产物中甘油二酯含量与理论纯度[7]

其中：甘油酯总百分量（%)为除脂肪酸外的TG、DG、MG百分量的总和;DG（%)为合成产物中甘油二酯的含量;TG（%)为合成产物中甘油三酯的含量。

1.2.4 反应条件对产物中各甘油酯含量的影响 影响酶促亚麻籽油甘油解制备甘油二酯的因素主要有底物比（亚麻籽油质量∶甘油质量)、反应时间、加酶量和反应温度，选择这四个因素进行单因素实验，每次实验重复三次，得到各因素对产物中各甘油酯含量的影响变化趋势，选择较优范围。

1.2.5 响应面设计 在单因素考察底物比、反应时间、加酶量和反应温度后，选择对反应产物中甘油二酯含量影响较大的反应时间、加酶量和反应温度三个因素，运用Design Expert 7.1进行响应面设计，以甘油二酯的纯度为依据优化反应条件。根据各因素单因素实验的结果和Lipozyme 435的反应推荐温度（40～60℃)，设计实验因素编码及水平见表1。

表1 响应面设计因素与水平表Table 1 Variables and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.6 脂肪酸组成分析 取少量产物油40μL，加入40μL正己烷溶解，点样于硅胶板进行薄层色谱分析，展开剂为石油醚∶乙醚∶乙酸（80∶20∶2，v/v/v)。用0.2% 2，7-二氯荧光黄的甲醇溶液喷涂后置于紫外灯下观察，最后刮下甘油三酯带或者甘油二酯带的硅胶，放入50mL圆底烧瓶中，加入一定量2%的H2SO4-甲醇溶液，密封置于70～80℃水浴回流反应一定时间，冷却后加入2mL正己烷，振摇促进甲酯化样品溶解，然后倒入一定量的饱和NaCl溶液升至瓶口，吸取正己烷层离心，取上层清液过无水硫酸钠柱得到脂肪酸甲酯，进行气相色谱分析[8]。气相色谱条件参考文献[9]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 底物比对甘油二酯与甘油三酯含量的影响据1.2.1所示方法，设定温度50℃，加酶量5wt%，反应时间5.5h，底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)分别为2∶1、1∶1、5∶3、5∶2、4∶1和5∶1的条件进行反应，结果如图1所示。

图1 反应底物摩尔比对甘油酯含量的影响Fig.1 Effect of substrate molar ratio on glyceride content

由图1可知，给定条件下反应产物中甘油二酯的含量随着底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)的升高先升高，在5∶3时达到最大值，之后便逐渐降低，而甘油三酯的百分含量变化与之相反。

2.1.2 反应时间对甘油二酯与甘油三酯含量的影响据1.2.1所示方法，设定底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)为5∶3，温度50℃，加酶量5wt%，反应时间分别为2、4、5、6、8、10、12、14h的条件进行反应，结果如图2所示。

由图2可知，给定条件下反应产物中甘油二酯的含量随着反应时间的延长而逐渐增加，当超过12h时，甘油二酯的含量增幅与甘油三酯的含量降幅逐渐减小，综合考虑甘油二酯含量以及反应周期问题，应将反应时间控制在4～12h以内。

图2 反应时间对甘油酯含量的影响Fig.2 Effect of reaction time on glyceride content

2.1.3 加酶量对甘油二酯与甘油三酯含量的影响 据1.2.1所示方法，设定底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)为5∶3，反应温度50℃，反应时间8h，加酶量分别为2wt%、5wt%、8wt%、10wt%和15wt%的条件进行反应，结果如图3所示。

图3 加酶量对甘油酯含量的影响Fig.3 Effect of enzyme load on glyceride content

由图3可知，给定条件下反应产物中甘油二酯的含量随着加酶量的逐渐增大而增大，甘油三酯的含量先降低后小幅上升，当超过8%时，甘油二酯的含量增幅逐渐减小，并趋于平衡，甘油三酯含量有小幅增加，综合考虑产物甘油二酯含量与酶成本问题，应该将加酶量控制在5wt%～15wt%之间。

2.1.4 反应温度对甘油二酯与甘油三酯含量的影响 据

1.2.1所示方法，设定底物摩尔比（亚麻籽油∶甘油)为5∶3，加酶量为5wt%，反应时间为8h，反应温度分别为45、50、55、60℃的条件进行反应，结果如图4所示。

图4 反应温度对甘油酯含量的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on glyceride content

由图4可知，给定条件下反应产物中甘油二酯的含量随着温度的增加首先增大，甘油三酯含量减少，当超过55℃时，甘油二酯的含量开始缓慢降低，甘油三酯百分含量有小幅增加，综合考虑产物甘油二酯含量、能耗、固定化酶的反应适宜温度等问题，应将反应温度控制在50～60℃左右。

2.2 响应面实验优化甘油二酯制备条件

2.2.1 响应面实验结果 见表2。

表2 甘油二酯制备响应曲面实验结果Table 2 Box-Behnken experiment design and corresponding experimental values of glyceride content

2.2.2 模型评价 采用Design-Expert 7对表2的实验结果进行分析得到回归方程和响应面图（图5～图7)。由图可以看出各因素对响应值的影响变化趋势，且回归模型存在最大值，说明各个因素都有一个最适合的值。甘油二酯含量回归模型p（Prob>F)＜0.0001，说明模型极显著，失拟项为0.1307，即P>0.05，影响不显著，说明模型拟合程度良好，该模型成功有效，实验误差小。一次项A、B、C以及二次项A2、B2、C2的P值小于0.0001，十分显著。优化后的回归方程为：

图5 反应温度与反应时间的交互影响Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effectofreactiontimeandreactiontemperatureonglyceridecontent

图6 反应温度与加酶量的交互影响Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of reaction temperature and enzyme load on glyceride content

图7 反应时间与加酶量的交互影响Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effect of reaction time and enzyme load on glyceride content

甘油二酯含量（%)=-315.63852+8.49491A+ 14.24422B+12.16780C-0.10154AB-0.10662AC-0.23967BC-0.056884A2-0.34094B2-0.21410C2

决定系数R2为99.45%，校正决定系数是0.9874，说明该模型能解释98.74%响应值变化，仅有1.26%的变异不能用此模型解释，说明回归方程的拟合程度很好，能够真实地反映数据结果。

2.2.3 最优解决方案 利用回归方程确定最佳甘油二酯制备条件，最佳条件为：反应温度58.3℃，时间9.1h，加酶量为8.8wt%。采用上述优化工艺参数进行亚麻籽油甘油酯制备富含α-亚麻酸的甘油二酯。在此条件下重复三次实验，甘油酯的平均含量达到50.21%，与预测值50.39%相比，其相对误差为0.36%，说明实验模型合理有效。

2.2.4 亚麻籽油与甘油二酯脂肪酸组成分析 假定总脂肪酸含量为100时，亚麻籽油及其合成产物的主要脂肪酸组成如表3所示。

表3 亚麻籽油及其合成产物的脂肪酸组成（%)Table 3 Fatty acid compositions of linseed oil and synthetic products（%)

由表3可以看出，亚麻籽油、反应产物以及甘油二酯中主要含有C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3n-6和C18∶3六种脂肪酸，其总量占到总脂肪酸的98%以上，经纯化后的反应产物中所得的不饱和脂肪酸总量达88.21%，亚麻酸含量达46.41%;甘油二酯中不饱和脂肪酸总量高达87.36%，亚麻酸含量达46.22%。

3 结论

采用响应曲面优化方法得到了Lipozyme435酶法催化亚麻籽油甘油解制备甘油二酯的最佳工艺，在各因素方差分析中表明在考察的范围内，反应时间、反应温度、加酶量以及三个因素间的交互作用对甘油二酯的得率影响均达到显著水平，在底物摩尔比为5∶3，反应温度58.3℃，时间9.1h，加酶量为8.8wt%的最优工艺下，反应产物中的甘油二酯得率达50.21%± 0.372%，纯化后的甘油二酯的理论纯度可达60.12%，α-亚麻酸的含量达46.41%。

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Study on preparation of diacylglycerol rich in α-linolenic acid from Linseed oil and glycerol by lipase catalyzed synthesis

LIU Yan-feng，HUANG Hui-hua*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Lipase-catalyzed synthesis of DAG production between linseed oil and glycerol in a solvent-free system by Lipozyme 435，factors research and response surface methodology were used to investigate the contribution of substrate molar ratio，reaction time，enzyme load and reaction temperature to diacylglycerol yield.The result showed the optimal parameters were as follows：substrate molar ratio of linseed oil to glycerol was 5∶3，enzyme load was 8.8wt%，reaction temperature was 58.3℃，and reaction time was 9.1h.Under the optimal conditions，DAG content could reach 50.21%in the reaction product.The theoretical purity of DAG oil could reach 60.12%after purification，and the content of α-linolenic acid reached 46.41%in the DAG oil.

linseed oil;α-Linolenic acid;diacylglycerol;glycerolysis;lipase catalyze

TS201.1

B

1002-0306（2012)07-0216-04

2011－06－29 *通讯联系人

刘艳丰（1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

国家863计划项目（2010AA101505)。