草菇有性世代间rDNA序列变异分析及RAPD分析

徐学锋，姬宏超，李巧玲，莫美华

(华南农业大学食品学院，广东广州 510642)

草菇有性世代间rDNA序列变异分析及RAPD分析

徐学锋，姬宏超，李巧玲，莫美华

(华南农业大学食品学院，广东广州 510642)

草菇的遗传与有性生殖过程存在很多的特殊性和不确定性，本研究以草菇V23菌株的成熟子实体弹射孢子，单孢分离后得13个单株，分别摇瓶培养、收集菌丝，提取总DNA，用通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增后连接、转化并测序，将单孢间和单孢与亲本间的ITS序列进行比对，分析草菇ITS序列多样性及变异性;同时以相应单孢菌株DNA为模板，用20条随机引物进行RAPD扩增。结果表明:草菇单孢间和单孢与亲本间的ITS序列相似度均在99%以上，相较于亲本的ITS序列，单孢序列中发现了有5个位点出现碱基转换，但没有两个以上的单孢发生同一转换;20条随机引物分别与14个样本进行RAPD扩增，其中3个引物出现多态性条带，带型结果发现单孢菌株间的带型差异呈现一定规律。草菇ITS序列变异较少，不适于单孢间的变异分析，而RAPD方法对摸索草菇有性世代间的遗传分离规律有重要价值。

草菇，ITS，RAPD，同宗结合

草菇(Volariella volvacea(Bull.ex.Fr.)Sing.)，是一种喜温、喜湿的草腐型食用真菌，又名苞脚菇、广东菇等，是我国南方食用菌栽培的主要品种之一。草菇的性模式十分复杂，其子实体产生的有性单孢子可以不与其它孢子融合而产生新的子实体。Chang等人［1－3］通过研究草菇抗性突变体、营养缺陷型等的分离规律，初步认为草菇是初级同宗结合菌。然而，早在1971年，S T Chang和C K Yau［4－5］发现在草菇的单孢子分离物中存在大量变异，这对已有的草菇遗传模式的解释提出了质疑，且到目前为止仍未得到充分解释。究其原因，主要是因为真菌不同于高等动植物，其自身的表观遗传特征不明显，可以用于遗传分析的性状更少，虽然抗性突变体、营养缺陷型等常规手段有一定意义，但终因获取困难、不够稳定等原因，无法系统广泛地应用到草菇的性模式研究中。在基因组分子层面，核糖体DNA中的内转录区间(internal transcribed sequence，ITS)序列是两个中度保守的区域，其进化速度较核糖体序列快，故而在一些物种的种内都存在明显差异，常用于真菌的遗传多样性及分子进化研究［6－9］。RAPD(random amplified polymorphic DNA)分析则已是一项非常成熟的分子技术手段，其核心是利用随机引物的PCR扩增，将基因组中无序、模糊的多态信息变成条理化、可以清晰比较的统计信息，从宏观上评估生物的遗产差异，常用于遗传多样性分析及分子辅助鉴定等等［10－12］。本研究拟测定草菇有性单孢分离株的ITS序列，比较亲子代菌株间的ITS序列差异，同时，对相应的菌株基因组进行RAPD分析，希望发现rDNA序列的变异规律及RAPD数据的分离规律，尝试在分子层面为揭示草菇有性遗传规律打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草菇菌株 常规栽培品种V23，由华南农业大学食品学院保藏;Taq酶、大肠杆菌DH5a、PMD－18－T载体、RNA酶等 购自Takara公司;引物 由上海捷瑞生物有限公司合成。

Eppendorf 5415D离心机，PCR仪，UVP凝胶成像系统等。

1.2 实验方法

1.2.1 单孢菌株分离及菌丝培养 取成熟子实体一只，收集有性孢子，在无菌条件下，利用无菌水将孢子进行梯度稀释，经镜检选择合适浓度涂PDA平板，置于35℃培养箱培养，发现孢子萌发立即挑出，置于新的PDA斜面培养保种。挑取斜面菌种接种于含PDA液体培养基的三角瓶中，35℃摇瓶培养5～7d，收集菌丝备用。

1.2.2 ITS片段的克隆与测序 取0.2g菌丝，置于液氮中碾磨，经SDS破壁、酚/氯仿抽提，用95%乙醇沉淀得基因组DNA，70%乙醇洗涤后溶于无菌水，检测质量后备用，详细步骤参见文献［11］。由公司合成通用引物ITS4和ITS5(见表1)后，以基因组DNA为模板，采用常规PCR程序进行ITS克隆，电泳检测后，以试剂盒回收目的片段，连接T－载体，转化大肠杆菌后，检测得阳性转化子，送公司测序。

表1 引物编号及其序列Table 1 Noumbers and sequence of primer

1.2.3 RAPD分析 以基因组DNA为模板，随机引物见表1，PCR扩增程序:94℃预变性3min，94℃变性40s，40℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，照相后进行多态性分析。

1.2.4 数据处理 ITS序列通过blast比对确认序列属性，经clustalX比对后分析不同序列间的差异;将RAPD图谱的带型转换成数据矩阵，采用Phylip3.6软件计算相似系数，得到相似系数矩阵，采用平均连锁聚类分析方法(Un weighted Pair Group Method with Arithmetic Clustering，UPGMA)进行聚类分析，构建树状图。

2 结果与分析

2.1 ITS序列分析

基因组DNA经测定OD260/280值在1.8～2.0之间，电泳检测条带整齐。以此为模板进行ITS序列片段的PCR扩增，得750bp左右的条带(见图2)，测序结果见图3，与Genbank数据库中的已知序列进行比较，与已登记的草菇ITS序列的相似性为99.8%，扩增所得序列确定为草菇V23的ITS片段。亲本与单孢子之间，单孢子与单孢子之间的 ITS序列用clustalx1.81软件进行完全比对，结果发现亲本与单孢子之间、单孢子与单孢子之间序列的相似程度很高，均在99%以上，其中单孢子分离株V1、V2、V7、V11、V12变异均是一个碱基的转换，没有发生碱基的插入或缺失，与亲代菌株比较，单孢子V1在129bp处发生了C—T转换，单孢子V7和V12分别在586bp和640bp处发现了G—A转换，单孢子V2和V11分别在471bp和284bp处发现T—C转换(见图3)。变异的位点较少，突变方向具有随机性，没有发现两个或两个以上的序列发生相同的变异位点。

图1 草菇基因组DNAFig.1 Genomic DNA of Volariella volvacea

图2 ITS序列的PCR产物Fig.2 PCR fragments of ITS

2.2 RAPD分析

20条随机引物分别与14个样本进行PCR扩增，其中S47、S48、S32出现多态性条带(图4)。由图中可以看到同一引物对不同菌株进行扩增所产生的DNA片段数目、分子量大小均不相同，其中S47与14个样品扩增所得电泳条带都表现较少，S48、S32条带数较多，最多达9条，最少0条。

表2 单孢子之间及与亲本之间的遗传相似系数矩阵Table 2 Genetic similarity matrix of parental isolate and single spore isolates

图3 13个单孢子菌株与亲本菌株V23ITS序列多态性的比较Fig.3 ITS nucleotide polymorphism between parental isolates V23and 13 single spore strains

图4 引物S47(a)、S48(b)、S32(c)的RAPD电泳图谱Fig.4 Electrophorogram of RAPD analysis with random primers S47(a)，S48(b)and S32(c)

将PCR多态性条带进行数据转换，采用Phylip3.6软件计算相似系数，得到相似系数矩阵(表2)，用Ntsys2.10e软件建立系统树状图(图5)。从系统聚类分析生成的树状图谱中可以看出，当遗传相似系数为0.53时，所有单孢子与亲本V23被聚类为一大类;当遗传相似系数升至0.612时，这14个菌株被分为3类。其中单孢子V1、V2、V3、V4为第一大类;V7、V8、V9、V10为第二大类;V5、V6、V11、V12、V13、V23为第三大类。随着相似系数的增加聚类越多;当相似系数达到0.88时，所有单孢子与亲本菌株可分为9大类。只有V11、V12与亲本菌株的亲缘关系最近;V7、V8与亲本的亲缘关系最远。通过遗传相似系数可以看出来草菇单孢子之间、单孢子与亲本之间在基因组多态性上存在很大的差异。

图5 草菇单孢子菌株及亲本V亲的遗传相似系数聚类图Fig.5 Cluster dendrogram of parental isolate and single spore isolates

3 讨论

核糖体DNA(rDNA)中的ITS1和ITS2是两个中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系研究。ITS序列片段较小，易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。王德信［7］利用ITS序列分析对3种天麻不同变异类型的亲缘关系做出了鉴定;徐学锋等［6，8－9］应用ITS序列研究了我国及亚洲地区lentinula属内及种间的系统发育关系。本研究比较了草菇亲子代菌株间的ITS序列间的差异，结果显示单孢菌株间、单孢与亲本菌株间的ITS序列的差异较小，说明草菇ITS序列的保守性较好，不适合用于比较单孢菌株间的差异以探讨草菇的性模式，应该寻求变异度较高的基因作为研究对象加以分析。

RAPD技术由于具有操作简单、分析速度快、成本较低、安全等优点，得到了广泛应用。陈剑［10］等利用RAPD技术鉴定了草菇杂交后代;傅俊生［11］等利用RAPD标记和SRAP标记对草菇杂交菌株2628做了鉴定和品比实验;余志晟［12］等利用RAPD对草菇栽培菌株DNA多态性进行了分析。本研究利用RAPD对草菇单孢子和亲本进行分析，不同引物的扩增效果有差异，20条随机引物进行扩增，只有S47、S48及S32出现了多态性条带;S47出现条带相对较少，引物S48和S32形成的RAPD条带较为清楚，效果较好，但总体数据略显不足。聚类分析的结果提示我们，RAPD技术可以应用于探索草菇有性生殖过程中的遗传分离规律。

对草菇性模式的探讨已有多年的历史，现在学术界基本倾向于草菇是一种初级同宗结合菌，但是草菇的有性遗传现象的表现不一致，存在不确定性。同宗结合是一个复杂的遗传过程，是部分细胞核发生变异后才发生遗传重组，还是同质细胞核间发生重组，这种重组是如何发生的等问题仍然没有得到合理解释，因此，基于染色体行为的研究必须应用大量的分子标记、DNA序列分析等新的方法才能打开新的局面。

［1］Chang S T，Chu S S.Nuclear behaviour in the basidium of Vovariella volvacea［J］.Cytofogia，1969，34:293－299.

［2］Chang S T，Ling K Y.Nuclearbehaviourin the Basidiomycete，Vovariella volvacea［J］.American Journal of Botany，1970，57:165－171.

［3］Li，Shuxian，CHANG Shu Ting.Selection and characterization of crystal－violet and malachite－green－resistant mutants in Vovariella volvacea［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，1991(7):541－550.

［4］Chang S T，Yau C K.Vovariella volvacea and its life history［J］.American Journal of Botany，1971，58:552－561.

［5］Raper C A.Sexuality and breeding［M］.New York and London:The Biology and Cultivation of Edible Mushrooms，1978: 83－117.

［6］Xu Xuefeng，Li Anzheng，Cheng Shuiming，et al.Reappraisal of phylogentic status and genetic diversity analysis of Asian population of Lentinula edodes［J］.Progress in Natural Science，2006，16(3):274－280.

［7］王德信.天麻ITS序列分析及变异类型鉴定［J］.生物技术，2010，20(6):33－35.

［8］徐学锋，李安政，程水明，等.亚洲香菇Lentinula edodes系统发育学地位的重新评估与遗传多样性分析［J］.自然科学进展，2005，15(10):22－29.

［9］徐学锋，林范学，程水明，等.中国香菇自然种质的rDNA遗传多样性分析［J］.菌物学报，2005，24(1):29－35.

［10］陈剑，林原，谢宝贵，等.利用RAPD技术鉴定草菇杂交后代［J］.食药用菌，2011，19(2):21－23.

［11］傅俊生，朱坚，谢宝贵，等.草菇杂交菌株2628的鉴定与品比实验［J］.中国农学通报，2010，26(14):48－53.

［12］余志晟，吕作舟，陈明杰，等.草菇栽培菌株DNA多态性的PCR－RFLP和RAPD分析［J］.农业生物技术科学，2005，21 (6):58－62.

Sequence variation of rDNA and RAPD analysis between sexual generations of Volariella volvacea

XU Xue－feng，JI Hong－chao，LI Qiao－ling，MO Mei－hua
(College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China)

The life history and sexuality pattern of Volariella volvacea are still uncertain and unclear.13 single sexual spores were isolated from strain V23，and cultivated in liquid medium to obtain mycelia for DNA extraction.Internal Transcribed Spacers(ITS)of these 13 isolates and V23were amplified and sequenced with primer ITS4 and ITS5.All theses sequences had over 99%similarity to homologous sequence from Genbank with multiple alignments，only five transitions but no transversion had been observed between two sexual Generations of Volariella volvacea.Less variation inter sexual spores revealed that ITS sequence was not the perfect gene for genetic analysis of Volariella volvacea.The random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis was performed with 20 random primers and genomic DNA which isolated from the 13 single spore strains and parent strain V23，PCR with only 3 random primers showed polymorphic bands，and some genetic separation regularity revealed that RAPD analysis had much more important value on research of sexuality pattern of Volariella volvacea.

Volariella volvacea;ITS;RAPD;sequence analysis

Q789

A

1002－0306(2012)10－0198－04

2011－10－10

徐学锋(1977－)，男，博士，研究方向:应用真菌遗传与生物技术。

国家自然科学基金(30800774);华南农业大学校长基金(2007K046)。