竹黄无性型菌的人工培养研究

韩燕峰，杜 文，梁建东，梁宗琦

（贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳 550025）

竹黄无性型菌的人工培养研究

韩燕峰，杜 文，梁建东，梁宗琦*

（贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳 550025）

采用培养特征观察，竹红菌甲素测定和分子生物学等技术和方法，研究了不同培养基上竹黄菌的生物量，产竹红菌素甲素和形成子座情况，结果表明，葡萄糖20g，琼脂20g，竹汁1000mL（竹枝200g煮沸取滤液），pH自然的培养基中并插入灭菌的竹枝，接入竹黄菌种，7d后，该培养基上菌丝生物量和其竹红菌素量均为最高，且约6个月室内室温（0～20℃）培养获得了类天然竹黄状的培养物，该培养物经过了竹红菌甲素测定及分子鉴定分析多途径的综合验证。通过本实验，竹黄无性型菌的人工培养取得一定进展。

竹黄菌，竹黄子实体，人工培养，竹红菌素，分子鉴定

竹黄菌（Shiraia bambusicolaP.Henn.）是一种主要寄生于短穗竹属（BrachystachyumKeng）一些种上的子囊菌[1]。竹黄菌的子实体（竹黄）是一种传统中药，它的主要生物活性成分是光疗色素——竹红菌甲素及多糖。其具有抗炎、镇痛、抗菌、光敏杀伤肿瘤细胞等多种功能，在医药、食品及植物保护等领域有广阔应用前景[2-6]。近年，又首次从竹黄菌中分离得到9个化合物，其中11，11-dideoxy verticillin A具有抗肿瘤活性[7]。新分离到的一个产漆酶菌株，经优化培养条件后，产漆酶酶活水平达120000U/L水平，与已报道的白腐真菌相比，具有发酵周期短且产漆酶酶活较高的优点[8]。特别值得一提的是，研究发现，竹黄菌不只是某些竹种的专性寄生菌。Zhu等[9]从蛇足石杉中分离到一株能产生石杉碱的内生竹黄菌分离体，Shiraiasp.SLf14。他们研究发现这株竹黄菌能产生具有增强记忆、改善记忆损伤和提高脑力活动效率等攻效的一种胆碱酯酶抑制剂——石杉碱。上述发现不仅提供了开辟生产石杉碱及漆酶的一种新选择，同时也为竹黄菌资源的开发利用拓展了空间。由于竹黄及竹红菌素应用研究成果的推动，在新菌株分离筛选[10-11]、分类及系统学[12-13]、生物学及遗传学[14-15]、液体培养优化、竹红菌素的提取[5，16-17]、原地保育人工接种及固体培养条件等方面的研究都有了新的进展。但是对保护竹黄自然资源和扩大利用范围有重要价值的异地培育、成功获得竹黄子座——子实体的实例则未见报道[18]。本文将报道作者在添加竹枝的固体培养基上，成功获得类竹黄子实体结构的实验结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株 竹黄菌Shiraia bambusicolaGZDXIFR-181菌株[10]，保存于贵州大学真菌资源研究所；短穗竹，竹红菌甲素（纯度98%） 南京康满林公司。

紫外分光光度仪为752型 上海第三分析仪器厂；基因扩增与测序 上海鼎安生物科技有限公司。

1.2 菌株活化及产子实体实验培养基的制备

1.2.1 斜面母种培养基 土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然。

1.2.2 实验用培养基配制

1.2.2.1 PDA培养基 土豆200g（煮沸取滤液），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然，标号A。

1.2.2.2 PDA培养基+竹枝 土豆200g（煮沸取滤液），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然，标号B。

1.2.2.3 大米玉米培养基+竹枝 大米150g，玉米粉50g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然，标号C。

1.2.2.4 大米玉米竹汁培养基+竹枝 大米140g，玉米粉40g，竹子20g（煮沸取滤液），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然，标号D。

1.2.2.5 竹汁培养基+竹枝 竹枝200g（煮沸取滤液），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m L，pH自然，标号E。

以上培养基配制好后，分别装入高11cm、直径7cm的玻璃瓶和500m L的三角瓶中，每瓶装入100m L培养基。然后将剪切长度为8cm的竹枝，以一根稍粗的竹枝作为中心，用棉线捆绑成直径约为2cm的竹枝束，插入除培养基A外的其余培养基中，1×105Pa灭菌30m in，备用。

1.3 接种培养及培养特征观察

式中Tmax为当代进出库序列中执行进出库作业时间最大值。以其作为适应度参数，可以保证适应度函数最大的序列作业时间最小，同时淘汰作业集合中执行时间最长的序列。

培养基冷却后，用接种针挑取少许已活化的菌种，接种在已灭菌的培养基中心，接种完成后用封口膜封好。置于26℃的恒温箱培养。第7d描述并记录菌丝生长及产竹红菌素的情况。

1.4 生物量测定方法

培养7d后，用游标卡尺测量记载竹黄菌在不同培养基上的菌落直径，观察菌丝的生长情况。之后刮下培养基上的气丝菌丝，置于已烘干恒重的纸片上，再一起放入50℃的干燥箱，24h后取出，温度降至室温（约20℃）后，于精密天平上称重，记录。

1.5 竹红菌甲素标准曲线的制备

精确称取竹红菌甲素标准品10mg，置于10m L容量瓶中，用无水乙醇溶解、摇匀，并定容至刻度，得标准品溶液。用无水乙醇稀释成10、20、50、100μg/m L系列浓度的标准品溶液。取系列标准品溶液各200μL，在紫外分光光度仪465nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。

1.6 处理样品竹红菌甲素的提取及测定

参照杜文等方法进行[4]，按竹黄菌干重∶无水乙醇=10∶6（mg∶m L）的比例，浸提24h，3000r/min离心，取上清液，用紫外分光光度计于波长465nm测定吸光度，基于标准曲线查值并计算竹红菌甲素的含量。

将待测材料按照Tigano-M ilani方法提取基因组DNA。对其ITS-5.8S区域采用ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAA GT CG TAACAAGG）进行扩增和测序，将菌株测得的ITS序列于GenBank上进行BLAST比对，选择相似性大于93%的菌株及其序列用CLUSTALX1.81作完全比对，经手工校正后，用Mega4.0软件构建系统树进行分子鉴定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

通过回归计算，其回归方程为Y=0.1669X-0.0004（R2=0.9984），其中X为465nm下的吸光度，Y为竹红菌甲素的含量（mg/m L），竹红菌甲素的标准曲线见图1。从图1可见，此标准曲线线性关系较好。可用于本实验的各项测定。

图1 竹红菌甲素的标准曲线Fig.1 Standard curve of hypocrellin A

2.2 竹黄无性型菌株的培养特征

在各培养基上培养7d，气生菌丝呈絮状或绒毛状，呈白色（图2）；培养10d后，菌落中央颜色变深，菌落天鹅绒状，红色素开始分泌，继续培养菌落颜色由白色逐渐转变成灰白色，菌落背面颜色变红褐色。其中，E号培养基（竹汁+竹枝）不仅菌丝生长丰满，且气生菌丝肉红色。

图2 在不同培养基上竹黄菌的生长差异Fig.2 Growth differencesof Shiraiabambusicola on severalmedias

2.3 不同培养基对竹黄菌生长和产竹红菌甲素的影响

不同培养基中竹枝对竹黄菌生物量和产竹红菌甲素的影响结果见图3。从图3看出，在PDA（A）和竹汁+竹枝（E）两种有植物液的培养基上，竹黄菌的生长速度、生物量和竹红菌素的产量都较高。而在以大米玉米为基础的碳源丰富的培养基上（C和D），即使加入竹枝诱导，其竹红菌素的含量和重量都最低。这或许提供了启示，植物浸出液中的其他生物活性物质对菌的生长和竹红菌素的形成有重要作用。

图3 不同培养基对竹黄菌生物量及产竹红菌甲素的影响Fig.3 Effectof severalmedias on the biomass and hypocrellin A production of Shiraia bambusicola

2.4 不同培养基对竹黄菌子实体的影响

各种实验用培养基经过6个月室温（0～20℃）的培养，仅见E培养基中产生约7个/瓶的团块状类子实体结构（S.bambusicola-like fruit body）（图4），灰白色，大小不同的类子实体的长宽范围为6.9~11.5mm，切开后内部灰黑色。制片观察未见产孢结构和孢子。采用前述方法测定竹红菌素的含量为10.27mg/L。

图4 人工培养基上的类竹黄子实体结构Fig.4 S.bambusicola-like fruitbody on an artificialmedium

将形成的子实体提取DNA和PCR扩增、测序，于GenBank上进行BLAST，下载相近序列和作者分离确定的GZDXIFR-181和GZDXIFR-171竹黄菌株序列建立系统发育树（图5）进行分子鉴定分析。从系统发育树可清楚观察到，人工培养的子实体与全部已知竹黄菌序列聚在一个进化分支中（支持率达99%）。分子证据有力验证了人工培养产生的类竹黄子实体结构是培养接种竹黄菌的培养物。在以竹汁为基础培养基上加入竹枝人工培养竹黄子实体获得了明显进展。

其次，B~E培养基都添加竹枝，只有培养基E中产生了该结构，其余均未见。因此从本实验结果看出，添加竹枝未必是产生子实体的主要因素。而通过过滤煮沸的竹枝获得的竹汁中，某些成分有可能刺激竹黄子实体的形成，有待进一步研究。

图5 人工培养子实体与GenBank中已知竹黄菌ITS序列构建的Mp系统发育树（Mega4.0）Fig.5 Phylogenetic tree（Mp）from Ac-fruitbody and GenBank sequences of Shiraia bambusicola（Mega.4.0）

3 结论与讨论

林海萍[19]在含竹笋50%，棉籽壳25%，米糠20%，玉米粉1%，蔗糖1%，CaCO32%，MgSO40.25%，KH2PO40.5%培养基中，试管培养约35d后，菌丝变红，长出原基，最后在培养料的顶部长出浅灰色的块状物，切片后见有分生孢子，但未检测到竹红菌素形成。而后再未见成功培养报道。因而假定子实体是否含有竹红菌素成了一个重要的判别指标。但最新研究发现，一种常见的产黄青霉Penicillium chrysogenum Thom也能形成竹红菌素[20]。因此，以形成竹红菌素作为唯一判别指标也有失偏颇。作者在研究中应用了解剖观察、竹红菌素形成和分子鉴定相结合的多途径方法更严谨地进行了考证。虽然解剖观察未见孢子，但产竹红菌素的结果和分子分析支持了作者培养获得的类竹黄子实体结构或许是未成熟的竹黄子实体。

现有研究已表明，竹的主要成分（90%以上）是纤维素和木质素，其他是少量的水、有机抽提物和灰分[21]。在不同竹种间及同种的不同部位，它们的同一化学成分含量都不同，特别是各种抽提物和灰分变异更大[22]。作者培养基中所用的竹种非原产地被竹黄菌寄生的短穗竹，且培养基中营养成分也较为贫乏。这可能是未能获得成熟子实体的原因之一。另一原因可能是由于长时间的培养而使培养基干燥，也阻碍了培养物的进一步生长发育。因此进一步的研究应考虑加富培养基和来自同一生境中共栖菌的应用。

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Artificial culture of the anamorph of Shiraia bambusicola

HAN Yan-feng，DUW en，LIANG Jian-dong，LIANG Zong-Qi*
（Institute of Fungus Resources，College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The biomass，hypoc rellin A and form ing fruitbody of Shiraia bambusicola on the d ifferentmed ias were exp lored.Through the method of culture characters，hypoc rellin A determ ination and molecular biology，the results showed thatm ycielia biomass and hypocrellin A were the best on the med ium consisting of g lucose 20g，agar 20g，bamboo filter liquor（bamboo pole 200g boiled）1000m L，and inserted sterile bumboo poles；And on above medium，S.bambusicola-like fruit bod ies were ob tained when the strain were inoculated and cultivated under the room temperature（0～20℃）lasting six months.S.bambusicola-like fruit bodies were confirmed by hypoc rellin A determ ination and molecular identification.The experiments showed that the fruit body of S.bambusicola on artificial culture made p rog ress.

Shiraia bambusicola；fruitbody；artificial culture；hypocrellin a；molecular identification

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0239-04

2012－02－20 *通讯联系人

韩燕峰（1978－），女，博士，副教授，主要从事真菌资源及其利用方面的研究。

国家自然科学基金项目（30960004）；贵州省自然科学基金项目[黔科合字（2008）2266号]；贵州大学引进人才科研项目[贵大人基合字（2007）035号]。