复合酶结合碱法制备麦胚多肽的研究

王成忠，高 超，赵乃峰

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南 250353；2.山东广明实业有限公司，山东滨州 250210）

复合酶结合碱法制备麦胚多肽的研究

王成忠1，高 超1，赵乃峰2

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南 250353；2.山东广明实业有限公司，山东滨州 250210）

研究了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合水解麦胚蛋白的最佳工艺，正交实验结果表明：酶解的最佳pH为6，底物浓度为5%，温度为50℃，水解时间为120min，加酶量为400U/g，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量的配比（活性比）为1∶1，多肽的提取率达到最高为89.87%。并且，本文将酶法和碱提方法相结合，调节pH 8.5左右，45℃碱提1h，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。本工艺与传统工艺相比，酶用量减少了，小麦胚芽多肽的提取率提高了，因此降低了生产成本。

蛋白酶，麦胚，多肽，碱提

小麦胚芽中蛋白质即小麦胚芽蛋白质（Wheat Germ Proein，WGP）含量高达30%左右[1]，其中清蛋白占30.2%，球蛋白占18.9%，麦醇溶蛋白占14.0%，麦谷蛋白占0.3%～0.37%，水不溶性蛋白占30.2%[2]。WGP是一种完全蛋白，它含有人体必需的8种氨基酸和2种半必需氨基酸，占总氨基酸34.74%[3-4]。研究发现，小麦胚芽蛋白中含有谷胱甘肽，具有清除自由基的作用。小麦蛋白生产制备的ACE抑制肽活性高、含量多，被认为是开发ACE抑制活性肽最具潜力的食物蛋白源。同时，麦胚蛋白多肽中还含有阿片活性肽，其主要功能有镇静镇痛；保护心血管、心肌；增强免疫力；调节胃肠运动；增强记忆力；调节内分泌、精神情绪和调整睡眠等作用[5-6]。本文利用两种酶复合降解小麦胚芽蛋白，使麦胚蛋白变成可溶的肽类而被分离出来[7]，并结合了碱提的方法提高其提取率。以往的研究中只选用单一酶，提取率不高且酶用量大。根据不同酶的酶切位点不同，两种酶的混合使用使蛋白质水解得更好，提取率更高，也节省了酶的使用量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂后的小麦胚芽 山东广明实业有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力为80万U/g）/中性蛋白酶（酶活力为20万U/g） 山东省发酵设计院。

RE-6000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；HH.SY21-Ni型恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；SHB-B95A型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；YP3001N型电子天平、ALC-210A型分析天平、722S分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；DL-5-B型离心机 上海安亭科学仪器厂；BCD-247E1型电冰箱 伊莱克斯公司。

1.2 工艺流程[7-10]

脱脂后的小麦胚芽→粉碎→加酶水解→利用食品级氢氧化钠调pH至8.5左右，45℃碱提1h→灭酶→冷却→离心→酶解液→多肽含量的测定

1.3 正交实验优化酶解工艺实验

取下列五个因子进行正交实验：提取温度（A），底物浓度（B），提取时间（C），pH（D），加酶量（E），每个因子取四个水平，具体的安排见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment table

1.4 多肽提取率的测定

采用离心的方法，收集上清液，得到麦胚水解液。取1m L定容至100m L，用Folin-酚法测定其多肽含量，根据以下公式得到提取率。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

从木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶四种蛋白酶中选出两种酶对脱脂后的小麦胚芽蛋白进行水解。

分别取20g脱脂麦胚（过60目筛，蛋白质含量36.5%左右）于四个250m L烧杯中，按照每种蛋白酶的最适反应条件（见表2）水解蛋白，离心后得到水解液，用Folin-酚法测水解液中多肽的含量，得出其提取率。其结果如图1。

表2 不同的蛋白酶的作用条件Table 2 The conditions of different proteases

图1 不同种蛋白酶与麦胚多肽的提取率的关系Fig.1 Relationship of different types of proteases and extraction rate ofwheatgerm peptides

由图1可知，提取率由高到低分别为碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，中性蛋白酶。因此，理论上要得到较高的提取率可以选择碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。但是，经过品尝后，碱性蛋白酶水解得到的水解液略有苦味，因此舍弃碱性蛋白酶，选择木瓜蛋白酶。从实验结果看出菠萝蛋白酶和中性蛋白酶提取率分别为53.84%和50.55%，相差不大。从经济角度考虑，中性蛋白酶的添加量为500U/g底物较菠萝蛋白酶添加量607U/g底物少，且由于中性蛋白酶是微生物发酵产生的，较菠萝蛋白酶价格便宜，同时中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的最适反应条件也很相近，因此，本次实验选用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶两种酶复合进行小麦胚芽多肽的制备。

2.2 最佳复合酶配比的选择

通过以上实验，我们选择了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。初定酶用量为500U/g，取其酶活比1∶3、1∶2、1∶1和2∶1的比例配比混合，在55℃，pH为6，底物浓度为6%的条件下水解2小时，测其水解液中多肽的含量，得出提取率，结果如图2。

图2 复合酶配比与麦胚多肽提取率的关系Fig.2 Relationship of enzyme ratio and extraction rate of wheat germ peptides

由图2可知，当木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的比例为1∶1时，其提取率最大。随着中性蛋白酶酶量的增加，提取率有所下降，可能是由于在水解麦胚蛋白时，木瓜蛋白酶起到主导作用，而中性蛋白酶的添加促进了木瓜蛋白酶的作用，因此将木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的配比定为1∶1。

2.3 最佳提取温度的选择

取20g过60目的脱脂麦胚5份于烧杯中，在加酶量为500U/g，木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶活力比为1∶1，pH为6，底物浓度为6%，温度分别为40、45、50、55、60℃条件下水解2h后比较多肽的提取率，结果如图3。

图3 温度与麦胚多肽提取率的关系Fig.3 Relationship of temperature and extraction rate of wheat germ peptides

由图3可知，温度的升高，增加了酶促反应速度，使提取率逐渐增大，但当温度升高至50℃以后，由于蛋白酶的稳定性降低，酶活也随之下降，因此提取率也逐渐降低。将实验的最适反应温度定为50℃。

2.4 最佳提取pH的选择

取20g脱脂麦胚5份于烧杯中，在50℃，pH分别为4、5、6、7、8的条件下水解2h，加酶量和底物浓度同上。通过Folin-酚法测得的多肽提取率的结果如图4。

图4 pH与麦胚多肽提取率的关系Fig.4 Relationship of pH and extraction rate of wheat germ peptides

从图4可看出，随着pH的升高，两种蛋白酶的活性增强，使麦胚多肽提取率逐渐升高，当pH为6和7时提取率较高，且相差并不大，说明这两种酶复合在一起时最适pH在6~7之间。随着pH的继续增大，使蛋白酶的活性受到抑制，提取率却随之减小。因此，将实验的最佳pH确定为6~7之间。

2.5 最佳提取时间的选择

分别取20g脱脂麦胚5份于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度为6%，加酶量同上的条件下水解30、60、90、120和150m in测定多肽提取率，结果见图5。

图5 时间与麦胚多肽提取率的关系Fig.5 Relationship of time and extraction rate of wheat germ peptides

从图5可以看出，提取的多肽量从开始的30min起呈明显的上升趋势，但到90m in基本达到稳定，说明90m in之前蛋白酶起到了显著的作用，酶解90m in以后，延长提取时间是无效的，并且酶解时间过长容易造成微生物的污染。因此，将实验的最佳提取时间定为90m in。

2.6 最佳底物浓度的选择

分别取20g脱脂麦胚5份于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度分别为9%、7%、5%和3%，加酶量同上的条件下水解90m in测定多肽提取率，结果见图6。

由图6可知，随着底物浓度的降低提取率逐渐升高，但这一条件不仅影响到多肽的提取率，同时也要考虑生产成本的合理性。从经济角度考虑，将最佳的底物浓度定为5%。

图6 底物浓度对麦胚多肽提取率的影响Fig.6 Relationship of substrate concentration and extraction rate ofwheatgerm peptides

2.7 最佳添酶量的选择

分别取20g脱脂麦胚5份于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度为5%，加酶量分别为200、300、400、500和600U/g，水解90m in后，测定多肽提取率其结果见图7。

图7 添酶量对麦胚多肽提取率的影响Fig.7 Relationship of the quantity of enzyme activity and extraction rate ofwheatgerm peptides

从图7可以看出，随着加酶量的增加，提取率趋于直线增加，但当加酶量增加到400U/g后基本趋于平稳，因此最佳添酶量为400U/g。

2.8 最佳酶解条件的确定

取提取温度（A），底物浓度（B），提取时间（C），pH（D），加酶量（E）五个因子进行条件实验，每个因子取四个水平，选用L16（45）正交表进行实验安排，详见表3。

通过表2分析可看出，各因素对提取率影响大小为B＞C＞A＞D＞E，即底物浓度对提取率有很大的影响，是关键控制因素，其次为提取时间。同时可确定最佳配方为A2B4C4D1E3，即提取温度为50℃，底物浓度为5%，时间为120m in，pH为6，加酶量为400U/g。

2.9 空白、验证及碱提实验结果

按照上面正交实验得出的结果进行验证实验，并做一个与其水解条件相同但不添加蛋白酶的空白实验作对照。在验证实验的基础上将酶解液的pH调节为8.5左右，45℃碱提1h后灭酶，离心得到酶解液，测其多肽提取率。得到的结果如表4。

上述结果表明，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合水解麦胚使麦胚多肽的提取率提高了60.22%，同时将酶法和碱提方法相结合，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。

3 结论

3.1 在木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量的配比（活性比）为1∶1的条件下，通过正交实验确定了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合水解麦胚蛋白的最佳工艺为：pH为6，底物浓度为5%，温度为50℃，提取时间为120m in，加酶量为400U/g，麦胚多肽的提取率高达89.87%。

3.2 通过验证实验得到：利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合水解麦胚蛋白使麦胚多肽的提取率与空白实验相比提高了60.22%，同时将酶法和碱提方法相结合，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。本工艺与传统工艺相比，酶用量减少了，小麦胚芽多肽的提取率得到了提高，降低了生产成本。

表3 正交实验结果及数据分析表Table 3 Orthogonal test results and data analysis table

表4 实验数据分析表Table 4 Test data analysis table

[1]樊永华.小麦胚芽蛋白制备及应用[J].粮食与油脂，2008（11）：11-13.

[2]Ke-xue Zhu，Hui-ming Zhou，Hai-fengQian.Proteinsextracted from defatted wheat germ：Nutritional and structural properties[J]. Cereal Chem，2006，83（1）：69-75.

[3]曲艺，王晓曦，雷宏.小麦胚芽及其脂类和蛋白质的研究现状[J].食品加工，2009（1）：31-34.

[4]张谦，张慧，孔建平.小麦胚芽蛋白质营养价值评价[J].新疆农业科学，1996（3）：108-109.

[5]辛志宏，吴守一，马海乐，等.从麦胚蛋白质中制备降血压肽的研究[J].食品科学，2003，24（10）：120-123.

[6]Irakoze Pierre Clzver，Huiming Zhou.Enzymatic hydrolysis of defatted wheatgerm by proteases and the effect on the functional [J].Journal of Food Biochemistry，2005，29（1）：13-26.

[7]殷微微，赵永焕，李永臣，等.酶法制备麦胚抗氧化肽过程的优化[J].黑龙江八一农垦大学学报，2008，20（8）：36-39.

[8]肖连冬，姬鄂豫，葛中巧.麦芽蛋白的提取及其功能特性的研究[J].酿酒，2005，32（1）：56-57.

[9]周利亘，陈新峰，王君虹，等.大豆多肽复合酶解工艺条件研究[J].食品科技，2005（7）：22-25.

[10]肖贵平.木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质[J].福建农林大学学报：自然科学版，2005，34（3）：78-86.

Study on preparation ofwheat germ peptides w ith multip lex enzymes and Alkali

WANG Cheng-zhong1，GAO Chao1，ZHAO Nai-feng2
（1.Departmentof Food and Biology Engineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China；2.Shandong Guang Ming Industrial Co.，Ltd.，Binzhou 250210，China）

The op timum enzymatic p rocess ofwheatgerm p roteins was studied in ourpaper，which was hyd rolyzed by the m ixture of papain and neutral p rotease.The op timum cond itions were investigated by orthogonal test. The results showed thatwhen ratio of papain to neutral p rotease was set as 1∶1，the maximum rate of pep tides extraction was up to 89.87%under the cond ition of pH6，substrate concentration 5%，temperature 50℃，time 120m in and consumed enzyme 400U/g.In addition，enzymatic and alkaline extraction methods were combined in this paper.The cond ition for extraction was pH 8.5，45℃，alkaline extracting for 60m in.Itwas p roved that the extracting ratio of wheat germ pep tides was increased from 89.87%to 93.76%.Compared with the trad itional p rocess，the enzyme consum p tion was decreased，and the rate ofwheatgerm pep tides extrac tion was increased，thus the p roduction costwas saved.

p rotease；wheatgerm；pep tides；Alkali

TS201.2

A

1002-0306（2012）14-0210-04

2011－10－25

王成忠（1964-），男，教授，研究方向：食品资源开发。