瑞香狼毒水提取物对人膀胱癌T24细胞Survivin表达的影响

申 彦 李建文 张雁钢

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医学科学院山西大医院泌尿外科，山西太原 030001

膀胱肿瘤是泌尿系肿瘤中最常见的肿瘤，多数为移行上皮细胞癌，国外膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中仅次于前列腺癌，居第2位，在国内则占首位。随着对生存素（Survivin）基因的研究深入，发现Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用，且与肿瘤的分级、分期密切相关。本研究应用中药瑞香狼毒水提取物作用于人膀胱癌T24细胞，探讨瑞香狼毒对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响，以期为临床开辟新治疗途径提供理论依据。现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 来源 人膀胱癌T24细胞株由山西医科大学寄生虫实验中心提供。瑞香狼毒购自山西省医药公司，山西医科大学药物学院进行药物提取。

1.1.2 主要试剂 RPMI-1640为赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产；二甲基亚砜（DMSO）为天津市科密欧化学试剂开发中心产品；丝裂霉素为日本协和发酵工业株式会社富士工厂产品；兔抗人Survivin单克隆抗体（工作液）为中杉金桥公司产品。

1.1.3 主要设备 超净工作台，相差倒置显微镜，二氧化碳恒温培养箱，水浴箱，水平离心机，全自动ELX800酶联免疫分析仪，流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将膀胱癌T24细胞复苏后接种至培养瓶，加含有10%胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养基5 mL瓶盖微松，放置37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中，每2～3天更换培养液，待细胞生长至贴满培养瓶壁时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测膀胱癌T24细胞抑制率 将细胞消化、计数，将其接种至96孔培养板中，每孔5×104个细胞，容积100 μL，置CO2培养箱中继续培养12 h细胞贴壁后，于96孔板中依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物（0.04、0.2、1、5 g/mL）每一浓度设6个复孔，同时设一个空白组（仅加入100 μL RPMI-1640培养基）和对照组（未加药物的100 μL细胞悬液）。继续培养 12、24、48、72 h 后， 每孔加入 MTT 试剂 20 μL，置CO2培养箱中继续培养4 h后弃上清，每孔加二甲基亚砜100 μL置摇床上混匀，10 min后用酶标仪在490 nm发射波长下读OD数值，计算细胞抑制率。抑制率的计算：抑制率=（1-OD处理组/OD对照组）×100%。

1.2.3 细胞凋亡率的检测 将对数生长期的膀胱癌T24细胞消化、计数，种植于6孔板内，每孔1×106个细胞，容积3 mL。待12 h细胞附壁后加入不同浓度药物。实验分为对照组（未加药物的 100 μL 细胞悬液），药物组（0.04、0.2、1、5 g/mL）每组设5个复孔，作用48 h后收集细胞，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 免疫细胞化学 取对数生长期膀胱癌T24细胞，消化、计数，种植于6孔板内，每孔1×105个细胞，容积3 mL。12 h细胞附壁后加药干预，实验分为对照组（未加药物的100 μL细胞悬液），药物组（0.04、0.2、1、5 g/mL）每组设 5 个复孔，作用48 h后进行免疫细胞化学染色，加入兔抗人Survivin单克隆抗体工作液，4℃温箱孵育过夜，次日滴加二抗（羊抗兔）、显色剂，封片后观察细胞Survivin蛋白的表达。实验以细胞胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性结果，在显微镜下拍照并行灰度值测定。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，多个样本均数间两两比较采用Bonferroni法检验，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测结果

瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞的生长抑制作用通过MTT法检测不同浓度药物分别处理12、24、48、72 h后，测各组细胞吸光度（表1）及抑制率（表2），结果显示瑞香狼毒水提取物对该细胞株有明显的生长抑制作用，浓度越高作用，时间越长，抑制作用越明显。

表1 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞作用的OD值（±s）

表1 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞作用的OD值（±s）

注：与对照组比较，★P＜0.05；每个药物浓度组与前一药物浓度组比较，△P＜0.05；每个时间段与前一时间段比较，○P＜0.05

药物浓度（g/mL）OD值12 h 24 h 48 h 72 h对照组0.04 0.2 15 0.69±0.03 0.61±0.03★0.56±0.07★0.40±0.02★△0.32±0.05★△0.73±0.04 0.57±0.03★0.43±0.02★△○0.37±0.06★0.28±0.03★△0.76±0.04 0.53±0.05★0.38±0.03★△○0.30±0.05★△○0.22±0.05★△○0.82±0.04 0.46±0.05★○0.28±0.05★△○0.23±0.05★○0.15±0.02★△○

2.2 凋亡率检测结果

药物组（0.04、0.2、1、5 g/mL）分别作用于膀胱癌 T24 细胞 48 h 后，细胞凋亡率分别为（11.67±2.61）%、（22.40±3.18）%、（38.29±2.30）%、（57.57±3.77）%，各组与对照组凋亡率[（1.05±0.34）%]比较差异有统计学意义（P＜0.05），高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，随着药物浓度的增高，膀胱癌T24细胞的凋亡率增加。

表2 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞增殖抑制率（±s，%）

表2 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞增殖抑制率（±s，%）

注：每个浓度组与前一浓度组比较，▲P＜0.05；每个时间段与前一时间段比较，◇P＜0.05

药物浓度（g/mL）抑制率12 h 24 h 48 h 72 h 0.04 0.2 15 12.49±4.09 19.10±9.68 42.33±3.52▲54.55±6.77▲21.99±4.48◇41.40±3.22▲◇48.86±7.65 61.16±4.48▲30.00±6.44 50.01±3.31▲60.74±6.64▲◇71.58±6.03▲◇44.72±5.67◇65.70±6.23▲◇71.58±5.84◇81.59±2.26▲◇

2.3 免疫细胞化学结果

药物组（0.04、0.2、1、5 g/mL）分别作用于膀胱癌 T24 细胞48 h后，经过免疫细胞化学染色、封片、显微镜下拍照后，测各组灰度值分别为（142.49±1.67）、（152.14±2.66）、（161.63±4.44）、（171.72±1.17），各组与对照组灰度值（130.84±4.99）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24细胞后，下调细胞中Survivn蛋白表达，浓度越高，下调作用愈明显。

3 讨论

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物，又名红狼毒、棉大戟、断肠草等，为中药狼毒之正品，有毒，用药部位为根，性味苦平，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究发现具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等活性[1]。国外膀胱癌的发病率在男性泌尿生殖肿瘤中仅次于前列腺癌，在我国则占首位。目前，国内外采用综合治疗措施，药物治疗在其中发挥重要作用。国内外学者在瑞香狼毒对肺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的研究中取得一定成果[2-4]，但对泌尿系统如膀胱癌细胞的抗肿瘤研究少有报道。Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制因子，具有高度保守性和明显抵抗细胞凋亡的作用，参与调控细胞分裂、增殖等过程[5]。Survivin在除胸腺外正常组织中不表达，而在大部分肿瘤细胞中高表达[6]。Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用[7-8]，其表达情况与肿瘤的分级、分期密切相关[9-10]，可以作为膀胱癌早期诊断及判断预后的检查指标[11]。本实验研究选择人膀胱癌T24细胞株，给予膀胱癌T24细胞不同浓度瑞香狼毒处理后，观察细胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表达的情况。结果显示：瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用，具有浓度和时间依赖性。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物促进膀胱癌T24细胞凋亡并下调Survivin蛋白的表达。

综上所述，瑞香狼毒水提取物可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，其作用机制可能与Survivin蛋白表达的下调有关。由于药物促使肿瘤细胞凋亡是通过多条途径共同作用的结果，因此需要进一步深入研究，为开辟膀胱癌临床治疗新途径提供理论依据。

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