唑来膦酸注射剂细菌内毒素检查的研究

高 峰 石 峰 魏国义

1.首都医科大学附属北京安贞医院，北京 100029；2.保诺科技（北京）有限公司，北京 102206

唑来膦酸是美国FDA批准的第3代双膦酸盐类药物，在临床上用于恶性肿瘤溶骨性骨转移引起的骨痛、恶性肿瘤引起的高钙血症以及老年原发性骨质疏松等骨吸收增加类疾病。目前国产的唑来膦酸注射剂主要有注射用粉针和注射液，且有多个厂家生产，国家食品药品监督管理局标准，进口药品注册标准等多个执行标准共存，其热原检查方法有家兔法和细菌内毒素法，不同标准的检查限度存在差异。为统一该品种的细菌内毒素检查标准，笔者按照《中国药典》2010年版附录中细菌内毒素检查法[1-2]，对唑来膦酸注射剂进行提高限度菌内毒素检查，以统一其标准，结果报道如下：

1 仪器与试药

TW12六孔恒温水浴 （产自Julabo公司）；MSI旋涡混合器（购自广州IKA公司）。

细菌内毒素工作标准品 （规格：每支120 EU，批号：150601-200699）购自中国药品生物制品检定所；细菌内毒素检查用水（规格：50 mL/支，批号：1105060）及鲎试剂（TAL）A（规格：0.1 mL/支，批号：1101202，灵敏度：0.25 EU/mL）购自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（规格：0.1 mL/支，批号：110603，灵敏度：0.25 EU/mL）购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；注射用唑来膦酸分别产自深圳海王有限公司，批号：20100502，吉林西点药业有限公司，批号：20100121，南京制药厂有限公司，批号：20101101；唑来膦酸注射液分别产自江苏正大天晴药业股份有限公司，批号：1005281，成都天台山制药有限公司，批号100601。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据限度最高的标准，注射用唑来膦酸细菌内毒素限值定为5.0 EU/g；唑来膦酸注射液细菌内毒素限值定为3.5 EU/mL。

2.2 鲎试剂灵敏度的复核

鲎试剂标示灵敏度（λ）的复核按照《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法的要求进行试验。检验结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

由表1可见，三批鲎试剂λC均在0.5λ～2.0λ之间，符合细菌内毒素检查的规定。

2.3 干扰预试验[3-7]

2.3.1 根据公式，最小有效稀释浓度C=λ/L，L值一般取5.0 EU/mg，目前市售鲎试剂灵敏度（λ）在 0.25～0.03 EU/mL之间，故注射用唑来膦酸进行细菌内毒素检测时的不同灵敏度鲎试剂所对应的最大有效稀释浓度分别为0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL。唑来膦酸注射液的限度L=3.5 EU/mL，故唑来膦酸注射液进行细菌内毒素检查的鲎试剂所对应的最小有效稀释倍数分别为 14、28、56、112。

2.3.2 预试验操作为取三批注射用唑来膦酸，用BET检查用水将样品稀释成 0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL共4个浓度梯度的溶液，将此系列浓度溶液标记为供试品管（NPC系列）。取两批唑来膦酸注射液，用BET检查用水分别将样品稀释14、28、56、112倍，以上述稀释液作为溶剂，溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2λ（0.5 EU/mL）的唑来膦酸溶液，标记此系列溶液为供试品阳性对照管（PPC系列）。取灵敏度为0.25 EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂进行试验，每一稀释度做两管，同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照（PC）和检查用水阴性对照（NC）各两管，结果见表2。

表2 样品干扰预试验结果

从表2可见，所用的三批注射用唑来膦酸的最大无干扰浓度不低于0.050 00 mg/mL，两批唑来膦酸注射液最小无干扰稀释倍数不高于14倍，在此条件下，受试样品对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应均无干扰作用。

2.4 正式干扰试验

用两个厂家的鲎试剂（灵敏度为0.25 EU/mL），按《中国药典》2010年版方法进行试验，测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。取三批注射用唑来膦酸，分别加BET检查用水稀释成0.05mg/mL，两批唑来膦酸注射液分别加BET检查用水稀释14倍，再用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成 2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ 浓度的 BET 水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液，每一稀释浓度重复4管，同时用上述供试品稀释液和BET水各做两管阴性对照管，按下列公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值（Es 和 Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4）。 见表 3。

表3 样品干扰试验结果

从表 3 结果可见，2.00λ 管均为阳性，0.50λ、0.25λ 管均为阴性，对于λ=0.25 EU/mL的两组鲎试剂的Es为0.25 EU/mL，Es均在0.50λ～2.00λ范围内，各批唑来膦酸制剂测得的Et均在 0.50λ～2.00λ 范围内，Et和 Es的比值在 0.5～2.0 之间，说明唑来膦酸制剂在该实验条件下对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无干扰作用。

2.5 样品细菌内毒素检查

取三批注射用唑来膦酸和两批唑来膦酸注射液，分别根据"2.4"项下方法制成供试品稀释液，使用两个厂家的鲎试剂按现行《中国药典》2010年版细菌内毒素检查法进行细菌内毒素检查，结果见表4、5。各批唑来膦酸注射剂的细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

细菌内毒素检查法是目前应用最为广泛的热原检查法的体外替代检测方法，但该方法存在易受到各种检测因素干扰的缺点，故统一其市面上流通的同一品种的限度标准，对提高其用药标准，改善其制剂工艺有着重要意义。本研究采用两个不同厂家不同灵敏度的鲎试剂对各个不同厂家生产的唑来膦酸注射剂进行试验，认为同样的细菌内毒素限度标准对它们进行质量控制是可行的，对于提高其注射用制剂的水平奠定了基础[7-8]。

表4 样品细菌内毒素检查结果1

表5 样品细菌内毒素检查结果2

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录 99.

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