HRV间接ELISA检测方法的建立及大庆市区腹泻患儿HRV感染率的调查

文程，王薇，余丽芸，侯喜林，单春桥，谭军，孙景秀

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319；2.大庆医学高等专科学校；3.大庆油田总医院；4.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

轮状病毒（Rotaviruses，RV）是引起人类和动物急性胃肠道传染病的主要病原体。它主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻，严重可导致脱水，进而引起水和电解质失衡而危及生命。轮状病毒性腹泻是世界上导致婴幼儿急诊和死亡的第二大疾病[1]，我国婴幼儿腹泻中32%～63%是因感染轮状病毒所致[1]。此外，轮状病毒对幼龄动物也能够产生巨大的危害。由于当今对轮状病毒腹泻尚无治疗的特效药物，因此建立方便、快速、灵敏的检测方法，随时监控轮状病毒感染的情况，对控制其感染大规模流行的发生尤为重要。

ELISA技术因其具有操作简便、快速，敏感度高、特异性强，适合大规模样本检测等优点，已广泛应用于各种病原体的检测。研究试图以人源轮状病毒（HRV）的全病毒作为包被抗原，建立检测HRV的间接ELISA方法，并利用所建立的方法，对大庆市区内儿童腹泻患者中的HRV阳性感染率进行检测，以初步分析HRV在大庆市区内的流行病学特征，进而为大庆市儿童轮状病毒性腹泻疾病的预防、诊断及治疗提供理论依据与技术指导。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株与血清

HRV参考毒株由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医实验室保存；HRV参考阳性血清是采集于临床上确诊的轮状病毒腹泻患者的血液样本分离制备而成，并经病毒中和试验证实为抗HRV阳性；HRV参考阴性血清是采集于非腹泻患者的血液样本分离制备而成，并经病毒中和试验证实为抗HRV阴性；1 452例待检血清采自大庆市区主要的二级以上医院的儿科门诊及病房的腹泻患儿。

1.2 主要试剂

胎牛血清购自法国PAA Laboratories；HSA、TMB为AMRESCO公司分装；脱脂奶粉购自宝泰克生物科技公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.3 病毒的纯化

应用差速离心法对分离的病毒进行纯化[2]，对纯化后的病毒经基因定量仪测定其浓度。然后，分装保存于-70℃，备用。

1.4 间接ELISA方法的建立

1.4.1 间接ELISA最佳反应条件的确定

按照设定的间接ELISA操作程序进行试验，确定间接ELISA各种最佳反应条件。

采用方阵滴定法和正交试验，分别对抗原的最佳包被缓冲液、抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度及酶标二抗最佳稀释度进行确定。用确定的最佳包被缓冲液以最佳包被浓度对浓缩纯化后HRV稀释后，4℃过夜包被酶标板，按间接ELISA操作程序，进行试验，测定OD450nm值，求出P/N值，以P/N值逐一确定最佳封闭液（5%脱脂乳-PBST、1%明胶-PBST、3%明胶-PBST）、最佳封闭时间（37℃封闭0.5、1、1.5、2、2.5 h）、血清与抗原最佳作用时间（37℃作用0.5、1、1.5、2 h，）、酶标二抗最佳作用时间 （37℃0.5 h、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h），最佳底物显色液及终止液及底物最佳显色时间，最终确立HRV间接ELISA检测方法的操作程序，并按此程序进行下面的试验。

1.4.2 间接ELISA检测方法的评测

1.4.2.1 重复性试验

通过板内、板间重复性试验，评测可重复性。

1.4.2.2 符合性试验

通过试验建立的间接ELISA方法与临床上应用的轮状病毒诊断试剂盒分别检测来自同一本体的50份血清及粪便样品，并对结果进行对比分析，以系统评测敏感度、特异性及符合性（阴性符合率为敏感性，阳性符合率为特异性，总符合率为符合性）。

1.5 大庆市区儿童腹泻患者HRV感染率的调查

于2011年7月—2012年3月期间，从大庆市区内的各二级以上医院的儿科门诊及病房，共采集1 452例腹泻患儿的血液样本；将采集的血样分离制备成血清后，用建立的HRV间接ELISA方法进行检测。并对检测结果按季节、腹泻患儿的年龄、地区、性别等方面进行统计学分析，进而得出大庆市儿童轮状病毒感染率在季节、地域、年龄、性别等方面上的差异。

2 结果

2.1 病毒的纯化结果

将鉴定好的HRV经差速离心浓缩纯化后，通过基因定量仪测定，得出该HRV抗原含量为2.89mg·mL-1。

2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定

采用方阵滴定法和正交试验，确定HRV最佳包被液为50 mM pH 9.6碳酸盐（CBS）缓冲液，抗原最佳包被浓度为10.0μg·mL-1，阴、阳性血清的最适稀释度为1∶200，酶标二抗的最适稀释度为1∶10 000。用确定的最佳包被缓冲液以最佳包被浓度对HRV稀释后，4℃过夜包被酶标板，按间接ELISA操作程序进行试验，优化并确定了最佳封闭液及使用浓度为3%的明胶，封闭时间为37℃1 h；血清与抗原最佳作用时间为37℃30min；酶标二抗最佳作用时间为37℃1 h；最佳底物显色液及终止液分别为TMB和1%SDS，底物最佳显色时间37℃10min。

2.3 间接ELISA方法评测的结果

通过重复性试验得出，板内、板间变异系数分别为2.27%～6.81%和3.71%～8.83%，根据Jacobson的报道[3]，表明间接ELISA方法在板内、板间的变异程度很小，说明具有较好的重复性。

通过符合性试验结果表明（表1），试验建立的间接ELISA方法与RV诊断试剂盒检测结果的阳性符合率为91.3%，阴性符合率为93.1%，总符合率分别为92%，说明试验建立的间接ELISA方法检测的结果灵敏、准确、特异性强。

表1 间接ELISA方法与RV试剂盒的检测结果Table1 Results of comparison testbetween indirect ELISA and RVkit

2.4 大庆市区儿童腹泻患者HRV感染率的调查结果

2.4.1 大庆市区内儿童腹泻患者的HRV感染的总体情况

对1452例腹泻患儿的血液样本进行HRV感染率检测的结果表明（图1），大庆市五个行政区（萨尔图区、让胡路区、龙凤区、大同区、红岗区）的HRV阳性感染率在38.6%～42.3%之间，平均为39.9%。经卡方检验，x2=1.05，P值＞0.05，说明大庆市区内各区域间儿童腹泻患者的HRV感染率无显著差异。

图1 感染阳性率Fig.1 HRV infection rateswith the children diarrhea in Daqing

2.4.2 不同季节，大庆市区内腹泻患儿中HRV的感染情况

对检测的结果按季节进行统计学分析。结果表明（图2），夏、秋、冬、春（早春）四季中的腹泻患儿的HRV感染率在22.7%～50.7%之间，其中以秋、冬两季较高，夏季最低。经卡方检验，x2=72.31，P值=0.000，有统计学意义，说明HRV感染率在季节间差异极为显著。其中，秋、冬两季经卡方检验，x2=1.22，P值＞0.05，无显著性差异；夏、秋两季经卡方检验，x2=53.19，P值＜0.05，差异非常显著；秋、早春两季经卡方检验，x2=5.15，P值＜0.05，有显著性差异。

图2 不同季节腹泻患儿HRV感染阳性率Fig.2 HRV infection rateswith the children diarrhea in different season

2.4.3 不同年龄段，儿童HRV感染的情况

依照儿童四个生长阶段，即婴儿期（28 d～1周岁）、幼儿期（1～3周岁）、学龄前期（3～6周岁）及学龄期（6～12周岁），对试验结果进行统计学分析。结果表明（图3），1～3周岁腹泻患儿中HRV感染率最高为56.0%，28 d～1周岁腹泻患儿次之，6周岁以后的腹泻患儿中HRV感染率最低，仅为14.6%。对这几组数据经卡方检验，x2=149.90，P值=0.000，说明不同年龄段的儿童HRV感染率差异非常显著。其中，婴、幼儿期经卡方检验，x2=2.03，P值＞0.05，无显著性差异；学龄前期、学龄期经卡方检验，x2=22.21，P值＜0.05，有显著性差异；婴儿期与学龄前期经卡方检验，x2=30.07，P值＜0.05，有显著性差异。

图3 不同年龄段腹泻患儿HRV感染的阳性率Fig.2 HRV infection rateswith the children diarrhea of differentage

2.4.4 不同区域，儿童HRV的感染情况

为深入研究大庆市五个主要城区各年龄段腹泻患儿的HRV感染情况，对试验结果按区域及年龄段进行了统计学分析。结果表明，各地区28 d～1周岁腹泻患儿中的HRV感染率差别不大，对结果经卡方检验，x2=0.96，P值＞0.05，表明无显著性差异；各地区1～3周岁腹泻患儿的检测结果经卡方检验，x2=6.47，P值＜0.05，有显著性差异；各地区3～6周岁及6～12周岁腹泻患儿的检测结果经卡方检验，x2值分别为0.36和0.31，P值均＞0.05，表明均无显著性差异。上述结果说明，在HRV易感的幼儿期阶段（1～3周岁），大庆市各地区腹泻患儿的HRV感染率体现出了明显的差异，说明HRV的感染可能与生活环境、卫生条件、密切接触、机体免疫等因素相关。

2.4.5 儿童腹泻患者HRV感染率的性别差异调查

按腹泻患儿的性别，对结果进行统计学分析。结果表明，各季节男、女性腹泻患儿的HRV感染情况均无显著性差异，说明轮状病毒感染与性别无关。

3 讨论

ELISA方法是由多个系统组成的，每个系统中的某一成分的相关参数的变化会对整个系统产生很大影响，导致试验结果不准，尤其是被包被病毒的纯度与ELISA试验的特异性和敏感性密切相关，如果毒性较弱或不纯，将会导致试验结果假阳性或假阴性的出现[4]。因此，试验首先利用差速离心技术对HRV进行浓缩纯化，以纯化后的HRV作为包被抗原，通过试验摸索了检测HRV间接ELISA方法的各项最佳条件，建立了间接ELISA操作程序，并通过重复性试验、符合性试验进行了系统的评测。结果表明，具有较好的重复性，用于快速检测HRV具有较高的敏感性，且特异性较强，检测结果灵敏、准确、真实、可靠。

利用试验建立的HRV间接ELISA检测方法，对2011年7月—2012年3月期间，大庆市区内的1 452例小儿腹泻患者进行了检测，结果表明大庆市近期儿童的HRV感染率平均为39.9%，在全国范围内的HRV感染率处于偏低的水平。在对大庆市五个主要城区儿童腹泻患者轮状病毒总体感染情况调查的基础上，对不同季节腹泻患儿轮状病毒的感染率进行了比较分析，结果表明，轮状病毒性腹泻秋冬季的发病率明显高于夏春季，这与处于世界温带地区的其他国家的儿童轮状病毒感染情况相一致[5]，说明轮状病毒感染以寒冷的秋冬季为高峰期。对不同年龄段的腹泻患儿HRV感染率的调查结果表明，1～3周岁的感染率（56%）略高于28 d～1周岁（51.1%），但明显高于3～6周岁（31.1%）和6～12周岁（14.6%），说明轮状病毒性腹泻在幼儿期的发病率较高，与其他研究结论一致；原因可能是由于处于该年龄段的儿童免疫系统发育不完善，免疫力低，易受轮状病毒感染所致；6个月以下的婴儿由于从母体处获得了一定的抗体，因此对轮状病毒感染有一定的抵抗作用；3周岁以后的儿童，免疫系统逐渐发育成熟，对HRV感染具备一定的抵抗力，因此即便是轻微感染HRV，也不致引起腹泻的发生。对大庆市各城区同一年龄段腹泻患儿HRV感染率的调查结果表明，各城区28 d～1周岁腹泻患儿的HRV感染率无明显差异，但在1～3周岁腹泻患儿中差异较为显著，位于市郊城区的该年龄段腹泻患儿的HRV感染率（如大同区72.5%、红岗区73.8%）明显高于主城区（如萨尔图区56.4%、让胡路区59.8%），且郊区的HRV腹泻患儿多数伴有其他感染症状，这可能与地区的卫生条件、经济状况、治疗不及时等因素有关。有关理论也证实，发展中国家的轮状病毒腹泻的发病率与死亡率要远高于发达国家[6]。对大庆市腹泻患儿的HRV感染率按性别进行调查的结果表明，男孩和女孩腹泻患者的HRV感染情况无显著性差异，说明轮状病毒感染与性别无关。

通过实验的各项调查，大体可以得出轮状病毒的感染与季节、年龄、卫生条件、经济状况及机体免疫力等因素有一定关系。所以，通过增强营养、注意个人卫生，保持环境卫生的清洁，并对婴儿提倡母乳喂养，对轮状病毒腹泻性疾病的预防应该能起到一定的作用；但仅通过改善食物、水源及环境卫生条件是不是能从根本上起到预防和控制HRV感染的作用，有待进一步证实。

[1]Fischer TK，Bresee JS，Glass RI.Rotavirus vaccines and the prevention of hospital-acquired diarrhea in children[J].Vaccine，2004，22（Suppl 1）：S49-54．

[2]黄志尚，黄祥瑞，杨佩英，等．Sindbis病毒的浓缩提纯[J]．中华微生物学和免疫学杂志，1981，1（2）:101-103.

[3]Jacobson R.Principles of validation of diagnostic assays for infection disease.In Office International des Epizooties Standards Commission（ed.），Manual of standards for diagnostic test and vaccines，3rd ed.Office International de Epzooties，Paris，France.1996，8-15.

[4]Miyakawa H，Kikuchi K，Jong-Hon K，et al.High sensitivity of a novel ELISA for anti-M2 in primary biliary cirrhosis[J].JGastroenterol，2001，36（1）:33-38.

[5]童志礼，方肇寅．婴幼儿轮状病毒流行的新趋势-G9型轮状病毒全球流行综述[J]．国外医学病毒学分册，2002（9）:117-120.

[6]Hausdorff WP.Prospects for the use of new vaccines in developing countries:cost is not the only impediment[J].Vaccine，1996，14（13）:1179-1186.