白花丹素体外抗细菌、真菌及其生物被膜活性研究

李欣燃，唐旭东，陈志宝

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆163319；2.深圳清华大学研究院深圳市创新中药及天然药物研究重点实验室）

目前，由于抗生素药物长期反复使用和滥用，临床上出现了超强耐药、多重耐药的病原体菌株，一些比较常见的菌体，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）等在临床上都出现了大量的耐药菌株，严重威胁着患者的身体健康和生命安全。因此，对病原菌耐药性的研究已成为当今一个热点，对耐药性病原体感染的预防和治疗也成为临床上亟待解决的一个问题。许多研究表明，病原菌形成生物被膜（Biofilm）是病原菌耐药的一个重要原因之一。

生物被膜，是指由微生物在接触表面粘附、生长而形成的菌体立体复杂群落，同时所形成的生物被膜中所包含的细胞外基质将分泌这些胞外基质的菌体包含其中[1]。这种复杂群落是微生物为了适应周围环境而形成相对于分散浮游态细胞而存在的一种独特形式。一方面，生物被膜可以保护在膜内的菌体不受抗生素等药物作用和人体免疫系统的攻击，另一方面，由生物被膜内释放出来的增殖菌体还会引起慢性感染和反复感染[2]。利用传统的抗生素难以将生物被膜完全清除，同时还会造成形成生物被膜相关菌体的耐药性。因此，开发对细菌和真菌生物被膜有抑制作用的抗菌剂在临床上具有重大意义。

白花丹素（Plumbagin，化学结构见图1），是广泛分布于我国华南地区的常见植物白花丹的主要活性成分，对其的开发利用早已有所报道，而主要集中在其所具有的抗肿瘤作用[3-5]，同时其还具有降低血脂作用[6]、抗寄生虫作用[7]、杀虫作用[8]，抗细菌和真菌作用也有所报道[9]，但对病原菌生物被膜活性作用研究尚未见报道。

图1 白花丹素的化学结构Fig.1 Chemical structure of plumbagin

因此，研究先采用微量稀释法分别考察白花丹素对S.aureus、E.coli和C.albicans的作用效果，再利用96孔微量滴定板分别建立上述三种病原菌的生物被膜模型，最后通过平板计数法检测白花丹素对细菌以及真菌所形成生物被膜的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及保存

菌株：S.aureus ATCC 29213、E.coil ATCC 25922和C.albicans ATCC 10231购于美国典型菌种保藏中心 （American Type Culture Collection，ATCC）。S.aureus ATCC 29213和E.coil ATCC 25922在米勒-希尔顿琼脂培养基（Muller-Hinton Broth Agar，MHA）中划板活化，然后在37℃条件下培养24～48 h后，放置于4℃保存备用；C.albicans ATCC 10231则用沙堡氏葡萄糖培养基（Sabouraud Dextrose Agar，SDA）划板活化，37℃条件下培养24～48 h后，放置于4℃保存备用。

1.1.2 药品及化学试剂

白花丹素购于中国药品生物制品检定所；白花丹素以二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）为母液配置成最终浓度为40 960μg·mL-1的药品实验用母液，密封保存于-20℃。MHA、MHB、SDA、SDB和96孔微量滴定板均购买于生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白花丹素对S.aureus ATCC 29213悬浮菌的MIC和MBC测定

依据临床实验室标准化协会M27-A标准，利用改良后的肉汤稀释法来检测白花丹素对S.aureus ATCC 29213悬浮菌的MIC和MBC。从保存于4℃的S.aureus ATCC 29213琼脂板菌株中挑取单菌落，接种于MHB培养基中，37℃震荡过夜培养。用MHB培养基调整菌液浓度，分光光度计测量时使其OD600值为0.4（～5×108 cfu·mL-1），并稀释到1×106 cfu·mL-1。用MHB培养基稀释药液，使药液终浓度为1 024μg·mL-1。在无菌96孔微量滴定板的每排第一孔中加入200μL终浓度为1 024μg·mL-1的药液，在第2孔到第10孔中加入100μLMHB培养基。在每排中，用100μL移液器从每排第一孔中移出100μL液体加入到各自排的第2孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到每排的第10孔，每稀释混匀一孔换一次枪头。在每排第11孔中加入200μLMHB培养基作为阴性对照，在每排第12孔中加入100μLMHB培养基和100μL稀释好的菌液作为正常生长对照孔。再在每排第1到第10孔中每孔加入100μL调好的稀释菌液。这样每排第1孔到第10孔中药液浓度分别为：512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg·mL-1，各孔中DMSO含量均小于1%[10]。将96孔微量滴定板放置在37℃温箱内孵育24 h。每个检测平行做3次，以视觉法判断最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），以96孔微量滴定板底部清亮孔为准，该孔中对应药物浓度为MIC。从MIC终点孔到第10孔中分别吸取10μL液体接种于MHA平板上，37℃温箱中孵育24 h。观察结果，接种平板中未见菌体生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。

1.2.2 白花丹素对S.aureus ATCC 29213生物被膜的MIC和MBC测定

从保存的S.aureus ATCC 29213 MHA琼脂板菌株中挑取单菌落，接种于MHB培养基中，37℃震荡过夜培养。用MHB培养基调整菌液浓度，分光光度计测量时使其OD600值为0.4（～5×108 cfu·mL-1），并稀释到1×105 cfu·mL-1。在无菌96孔微量滴定板中的每孔中加入200μL调好的菌液。将96孔板放置在37℃温箱内孵育48 h。使96孔板底部出现明显的生物被膜结构。小心吸弃孔中200μL液体，再向每孔中加入250μL PBS，并吸弃，如此洗膜3次。操作过程中注意不要破坏生物被膜结构。在无菌离心管中用MHB对药物以初始浓度为2 048μg·mL-1进行两倍浓度的连续稀释，并按顺序在相应孔中加入相应浓度稀释好的药物溶液200μL，每排第12孔中加入200μLMHB培养基作为正常生长对照孔。37℃温箱内孵育24 h。再吸弃孔中液体，用PBS按上述方法清洗一次，再加入200μL PBS，重悬后均匀混合，取10μL接种于MHA平板上，再在37℃温箱内放置24 h。该实验同样也平行做3次。观察结果，与正常生长对照孔比较，菌体生长情况相等或最先受到抑制的平板对应的孔中药物浓度为MIC，以接种平板中未见菌体生长的最低药物浓度为MBC。

1.2.3 白花丹素对E.coil ATCC 25922悬浮菌的MIC和MBC测定

测定方法与1.2.1中的测定方法相同。

1.2.4 白花丹素对E.coil ATCC 25922生物被膜的MIC和MBC测定

测定方法与1.2.2中的测定方法相同。

1.2.5 白花丹素对C.albicans ATCC 10231悬浮菌MIC和MBC测定

首先从保存C.albicans ATCC 10231的琼脂板菌株中挑取单菌落，接种于SDB中，37℃震荡培养16 h。用SDB培养基调整菌液浓度，用分光光度计测量时使其OD600值为1（～3×107 cfu·mL-1），并稀释到106cfu·mL-1。用SDB稀释药液，使药液终浓度为1 024μg·mL-1。取无菌96孔微量滴定板，在每排第1孔中加入200μL终浓度为1 024μg·mL-1的药液，在第2孔到第10孔中分别加入100μL SDB培养基。调药及加菌液浓度方法同1.2.1。

1.2.6 白花丹素对C.albicans ATCC 10231生物被膜菌MIC和MBC测定

菌液浓度调整方法同上。实验操作方法同1.2.2，所不同之处在于被膜孵化温度和平板中菌体生长温度均为30℃。MIC和MBC终点判读方法同1.2.2。

2 结果

2.1 白花丹素对S.aureus ATCC 29213悬浮菌和生物被膜的M IC和MBC

如表1所示，白花丹素对S.aureus ATCC 29213悬浮菌的MIC和MBC分别为4μg·mL-1，32μg·mL-1；对S.aureus ATCC 29213生物被膜的MIC和MBC分别为32μg·mL-1和128μg·mL-1。从结果可知，白花丹素对S.aureus ATCC 29213的悬浮态具有明显的抑菌效果，而对生物被膜态菌的抑制效果较弱。

表1 白花丹素抗S.aureus ATCC 29213活性检测结果Table1 The results of plumbagin against S.aureus ATCC 29213

2.2 白花丹素对E.coil ATCC 25922悬浮菌和生物被膜的M IC和MBC

结果如表2所示，白花丹素对E.coil ATCC 25922悬浮菌的MIC和MBC分别为32μg·mL-1，64μg·mL-1；对E.coil ATCC 25922生物被膜的MIC和MBC分别为64μg·mL-1和>2 048μg·mL-1。从结果可知，白花丹素对E.coil ATCC 25922的悬浮态及形成生物被膜后同样有较明显的抑菌效果。

2.3 白花丹素对C.albicans ATCC 10231悬浮菌和生物被膜的M IC和MBC

白花丹素对C.albicans ATCC 10231悬浮菌的MIC和MBC分别为4μg·mL-1和8μg·mL-1；而对生物被膜菌的MIC和MBC分别为64μg·mL-1和>2 048μg·mL-1，结果如表3所示。这说明白花丹素对白色念珠菌也有较好的抗性。

表2 白花丹素抗E.coil ATCC 25922活性检测结果Table2 The results of plumbagin against E.coil ATCC 25922

表3 白花丹素抗C.albicans ATCC 10231活性检测结果Table3 The results of plumbagin against C.albicans ATCC 10231

3 讨论

自从1933年Arthur T.Henrici首次报道了细菌在水环境中形成生物被膜的现象以来[11]，生物被膜的严重危害及其形成过程已被研究者所熟知，并且随着分子生物学、微生物学等学科技术的发展，人们逐渐认识到引起疾病的病原菌不只是以悬浮状态存在，同时还以生物被膜的形式存在，不仅如此，生物被膜态的菌体还可能是病原菌引起疾病的主要形式。而要清除生物被膜态存在的病原菌所需要的抗生素的用量往往对人体具有不能承受的毒性。由实验结果也直接说明，白花丹素对金黄色葡萄球菌生物被膜菌的MIC值是对其悬浮菌MIC值的32倍；对白色念珠菌来说，白花丹素对生物被膜菌的MIC值是对悬浮菌MIC值的16倍；只有大肠杆菌，白花丹素对其生物被膜菌的MIC值仅是对悬浮菌MIC值的2倍。这也说明治愈由生物被膜引起的感染需药量要大大增加。

目前对于联合用西药来抑制清除菌体生物被膜的研究成为热点，虽有效果但效果都不是很显著[12]，同时还不利于药物耐药性的控制。因此，从药物毒性小、无耐药性而且来源丰富的天然药物中寻找清除生物被膜的有效成分成为治疗或辅助治疗生物被膜相关疾病的有效的新途径。

对于生物被膜的研究目前已经成为一个热点，一方面集中在生物被膜的特性以及生物被膜本身形成过程及其分子机制的研究上，另一方面集中在了解生物被膜的危害以及寻找抑制清除生物被膜有效药物的研究上。如Ramage的研究小组研究发现[13]，适当浓度的法尼醇可以阻抑白色念珠菌生物被膜的形成，同时他们还分别从mRNA水平和蛋白水平考察了法尼醇对白色念珠菌hwp1基因的表达情况，发现法尼醇可以有效降低该基因的表达。本试验就是从后一个角度出发，利用天然药用植物白花丹中的主要有效成分白花丹素作用于细菌和真菌的生物被膜，以检测其对细菌和真菌生物被膜作用活性，而且可以结合第一个方面，对白花丹素抑制细菌、真菌生物被膜作用的分子机制可做进一步研究。因为生物被膜的形成是菌体的积聚，因此，生物被膜随着时间的推移应该呈现出不同的生物学特性，所以，药物对其的作用不仅仅应该考虑药物浓度的不同，同时还应该考虑生物被膜形成时间和药物作用时间。

目前对于药物对生物被膜的作用主要集中于体外研究，这就忽略了体内药物作用的诸多因素，比如药物进入人体后作用浓度会发生改变等因素，因此，对于药物作用于生物被膜的研究要应用于临床，就要进行体内研究。

总之，白花丹素具有抗细菌和真菌活性，不仅如此，白花丹素在一定浓度下还具有明显的抑制细菌和真菌生物被膜的活性。因此可以说，试验为进一步防治生物被膜感染提供了一条安全有效的用药新思路，在临床上具有较大的开发利用价值。研究还可进一步深入，一方面我们可以对白花丹素抑制生物被膜形成的作用机制进行研究，另一方面我们还可以检测白花丹素在体内对生物被膜作用效果，同时还可以考虑将其作为增效剂来增加病原菌相对药物的药效和减少相对药物的用量。

[1]Lopez D，Vlamakis H，Kolter R.Biofilms[J].Cold Spring Harb Perspect Biol.2010，2（7）:a000398.

[2]Skrlin J.Biofilm——still a problem?[J].Lijec Vjesn，2010，132（1）:24-26.

[3]杜泽乡，孙情，乔伟，等.白花丹素对人舌癌Tca细胞增殖及凋亡作用的探讨[J].时珍国医国药，2011，22（4）：942-944.

[4]Tian，L.，et al.，Plumbagin induces apoptosis via the p53 pathway and generation of reactive oxygen species in human osteosarcoma cells[J].Mol Med Report，2012，5（1）:126-132.

[5]Thasni K A，Rakesh S，RojiniG，et al.Estrogen-dependent cell signaling and apoptosis in BRCA1-blocked BG1 ovarian cancer cells in response to plumbagin and other chemotherapeutic agents[J].Ann Oncol，2008，19（4）:696-705.

[6]Sharma I，Gusain D，Dixit V P.Hypolipidaemic and antiatherosclerotic effects of plumbagin in rabbits[J].Indian JPhysiol Pharmacol，1991，35（1）:10-14.

[7]Chan-Bacab M J，Pena-Rodriguez L M.Plant natural products with leishmanicidal activity[J].Nat Prod Rep，2001，18（6）:674-688.

[8]Lee C H，Lee H S.Acaricidal activity and function ofmite indicator using plumbagin and its derivatives isolated from Diospyros kaki Thunb.roots（Ebenaceae）[J].JMicrobiol Biotechnol，2008，18（2）:314-321.

[9]de Paiva，S.R，Figueiredo M R，Aragao T V，et al.Antimicrobial activity in vitro of plumbagin isolated from Plumbago species[J].Mem Inst Oswaldo Cruz，2003，98（7）:959-961.

[10]Pierce C G，Thomas D P，Lopez-Ribot J L.Effect of tunicamycin on Candida albicans biofilm formation and maintenance[J].JAntimicrob Chemother，2009，63（3）:473-479.

[11]Henrici A T.Studies of Fresh water Bacteria:I.A Direct Microscopic Technique[J].JBacterio，1933，25:277-287.

[12]Monzon M，Oteiza C，Leiva J，et al.Synergy of different antibiotic combinations in biofilms of Staphylococcus epidermidis[J].J Antimicrob Chemother，2001，48（6）:793-801.

[13]Ramage G，Saville S P，Wickes B L，et al.Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol，a quorum-sensing molecule[J].Appl Environ Microbiol，2002，68（11）:5459-5463.