一株鸡呼吸型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

李晓峰,郑振宇,杨红瑞,许保疆,张怡磊

（1.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002；2.邓州市劳动就业训练中心,河南邓州474150；3.河南省农业科学院,河南郑州450002；4.邓州市畜牧局,河南邓州474150）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）所致的一种急性、高度接触性传染病,主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统[1].目前,鸡传染性支管炎的临床分型主要包括呼吸型、生殖型（又称产蛋鸡变异型）、肾型、腺胃型等,此病是养鸡业中常见的、危害严重的传染病之一[2].呼吸型传染性支气管炎是鸡传染性支气管炎的一种病理表现形式.近几年来,呼吸型传染性支气管炎在我国蛋鸡群中广泛流行,给养鸡生产带来了严重的经济损失[3].IB主要见于20～50日龄的仔鸡,表现为突然发病,迅速传播,特征性症状是粪便中白色尿酸盐成分增加,死亡率为5%～30%.鸡传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属的一个代表种,该病毒主要存在于病鸡呼吸道渗出液中,主要传播方式是经呼吸道感染,也可通过消化道传播.鸡感染呼吸型传染性支气管炎的主要病变特征是肾脏肿大,呈花斑型[4].1972年在广东省有传染性支气管炎存在,随后绝大多数省份相继发生该病,在此期间发生的传染性支气管炎也主要为呼吸型.20世纪90年代以来,呼吸型传染性支气管炎在国内曾经相继爆发.近几年来,鸡呼吸型传染性支气管炎的发病率逐年增加,死亡率较高,80%商品蛋鸡发病后会影响产蛋率[5].此外,该病的高度传染性和病原多血清型性,使得免疫预防复杂化并增加费用.感染鸡生长受阻,耗料增加,产蛋和蛋质下降、死淘率增加,并继发感染气囊炎,导致肉鸡加工过程中的废弃.因此,本病常给养鸡业造成极大的经济损失[6].

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

本试验于2012年3月至4月间在河南农业大学禽病研究所进行.

1.2 试验动物

2012年3月,新郑市某鸡场36日龄蛋鸡发病,临床表现为呼吸困难,精神沉郁,采食量下降,拉白色水样稀便,病初零星死亡,几天后死亡率逐渐增加.病理剖解可见呼吸道粘膜出血充血,肾脏肿大呈“花斑肾”.根据临床、病理剖解结果分析,怀疑病鸡感染呼吸型传染性支气管炎而发病,采取病鸡肺、气管组织,保存备用.

试验用9～11日龄的SPF鸡胚和5日龄SPF雏鸡购自北京梅里亚动物保健公司.

1.3 试验主要仪器及药品

SW-CJ-2G.37双人净化操作台（苏州净化设备有限公司）,HG303-4恒温箱（南京实验仪器厂）.

胰蛋白酶购自郑州亿诺化工有限公司,工作浓度为1.5%；NDV LaSota株购自哈尔滨维科生物技术开发公司；鸡红细胞采自SPF鸡,工作浓度为1.0%；青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司,工作浓度为1 000 IU.

1.4 操作过程和方法

1.4.1 病毒分离 病料采集与无菌处理,取临床表现呼吸困难、病理剖检表现为肾肿大呈“花斑肾”的病死蛋鸡气管和肺脏组织,在无菌操作台上剪碎,加入灭菌生理盐水,按1∶5稀释后研磨制成悬液,每mL加入青霉素1 000 IU和链霉素1 000 IU,4℃处理1.5～3 h,然后反复冻融3次后,按照3 000 r/min离心5 min,取上清液接种8枚9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔,0.2 mL/胚,用石蜡封住注射部位,并标注日期和时间（见图1、图2）.然后将其放置于37℃温箱.每天照蛋2次,将死胚放置于4℃冰箱过夜,弃去24 h内死胚,收取48～72 h内死胚尿囊液（见图3）.死胚尿囊液接种另一组鸡胚,未死鸡胚至接种120 h后置4℃冰箱冻死,观察鸡胚病变,连续盲传5代[7].

图1 接种Fig.1 Vaccination

图2 封口 Fig.2 Seal

图3 收集尿囊液Fig.3 Collect allantoic fluid

1.4.2血凝特性试验 取第3代SPF鸡胚尿囊液,经3 000 r/min离心5 min后,将上清液分为2份,其中1份按终浓度加入1.5%的胰蛋白酶,另1份不作任何处理,同时用灭菌生理盐水按同样方法处理作为对照.37℃水浴2 h后,常规微量法测定病毒的红细胞凝集价,以出现100%凝集的病毒最大稀释倍数作为该样品的红细胞凝集价[8].

1.4.3 鸡胚矮小化试验 取10枚10日龄SPF鸡胚平均分为2组.试验组取第1代死亡鸡胚尿囊液,经尿囊腔接种5枚,每胚接种0.2 mL,连续传代,同时设对照组用灭菌生理盐水接种,观察鸡胚死亡情况[9].

1.4.4 鸡新城疫干扰试验 将10日龄SPF鸡胚分A、B、C、D共4个组,每组5枚：A组,取分离株第3代SPF鸡胚尿囊液经尿囊腔接种鸡胚,每胚0.2 mL,37℃孵化10 h后复种NDV LaSota株,每胚0.2 mL；B组,将分离株第3代SPF鸡胚尿囊液和NDVLaSota株同时经尿囊腔接种鸡胚,每枚0.2 mL；C组,将NDV LaSota株经尿囊腔接种鸡胚,每枚0.2 mL；D组,无菌生理盐水经尿囊腔接种鸡胚,每枚0.2 mL,作为阴性对照.以上各组鸡胚置37℃继续孵化72 h后,4℃冻死鸡胚,无菌收集尿囊液,常规微量法进行血凝试验,以出现100%凝集的病毒最大稀释倍数作为该样品的红细胞凝集价[10].

1.4.5 琼脂凝胶扩散试验 按照常规方法制作琼脂板、打孔,然后加入IB抗原和血清.按照常规方法制作琼脂板、打孔,然后加入抗原和血清中央孔7加入标准阳性血清.1、4孔加入标准琼扩抗原,2、3、5、6孔各加入发病鸡血清,添加至孔满为止,待孔中液体吸干后将平皿倒置,放在湿盒内,置37℃温箱24～72 h,逐日观察3 d,并记录结果.

1.4.6 RT-RCR试验 RT-PCR验证引物设计参照Zwaagstra等的报道,按照TRizol RNA提取试剂盒的方法从分离病毒第5代尿囊液中提取病毒RNA,随后进行RT-PCR、电泳试验,并设阳性尿囊液对照[11].在电镜下观察并拍照.

1.4.7 动物回归试验 将20羽15日龄非免疫蛋鸡,随机分为2组,每组10羽,分为人工感染组（A组）和正常对照组（B组）,分笼隔离饲养.将分离株第5代SPF鸡胚尿囊液分别经口、鼻、眼接种A组鸡,每羽0.2 mL；B组鸡经相同途径接种等量灭菌生理盐水.之后每天观察各组鸡的临床表现,对病死鸡进行剖检,并记录病理变化.

2 结果与分析

2.1 病毒分离

病料采集与无菌处理后,经鸡胚连续盲传5代,获得了1株病毒.

2.2 血凝试验结果

血凝试验显示分离株尿囊液血凝价为零,经1.5%胰蛋白酶处理后血凝价为7ln2,对照胚尿囊液经处理后血凝价为3ln2（见表1）.结果表明,该病毒本身不能凝集红细胞,但经过1.5%胰蛋白酶处理后能够使红细胞发生凝集.

表1 分离株IBV的HA价测定结果Tab.1 The HA price determination resulte of the isolates of IBV

2.3 鸡胚矮小化试验结果

病变组织处理后,经鸡胚尿囊液接种10日龄SPF鸡胚,在初次传代时,胚体表现轻度出血,但是支气管没有肉眼可见的病变.在盲传3～5代后,鸡胚生长发育明显受到抑制,出现侏儒胚、蜷曲胚或者畸形胚等现象（见图4）.有的胚体呈弥漫性出血,尤其是头部出血比较明显.羊膜增厚,卵黄囊皱缩,部分鸡胚尿囊液有白色尿酸盐结晶.

图4 对照胚（左）及侏儒胚（右）Fig.4 The control embryo（left）and dwarfembryos（right）

2.3 鸡新城疫干扰试验

结果显示分离株接种鸡胚10 h后复种NDV,可明显干扰NDV在鸡胚中的增殖；如果两种病毒同时接种鸡胚,则对NDV在鸡胚中的增殖影响不大（见表2）.

表2 经IBV干扰后的NDV的HA价测定结果Tab.2 The HA price determination results ofNDV after the interference by IBV

2.4 琼脂凝胶沉淀试验

结果显示,在标准阳性血清与标准抗原孔之间形成致密沉淀线,并与阳性对照沉淀线平滑相连（见图5）,表明该试验结果为阳性.

2.5 RT-PCR试验

由电泳试验结果显示本试验提取的病毒为IBV阳性,即该病毒为鸡呼吸传染性支气管炎病毒（见图 6）.

图5 琼脂扩散试验Fig.5 Agar diffusion test

图6 右3为阳性对照Fig.6 The control group in the third of right

2.6 动物回归试验

A组10羽鸡于攻毒后3 d,鸡群开始出现喘气和气管哕音（见图7）,随后表现精神萎顿、食欲不振、拉白色稀粪、嗜睡等临床症状,接种后6 d死亡2羽,接种后10 d死亡3羽.剖检病死鸡,均见肾脏肿大、色白,输尿管和肾小管内充满白色尿酸盐并呈菜花状（见图8）.早期病死鸡的气管内和肺部充血、出血和少量黏液.对照组一切正常.说明分离株可引起雏鸡发病,早期主要侵害雏鸡的呼吸系统,中后期则主要侵害雏鸡的泌尿系统,这符合呼吸型传染性支气管炎病毒的感染特征.

图7 呼吸困难 Fig.7 Difficulty in breathing

图8 肾脏肿大,有尿酸盐沉积,呈“花斑肾”Fig.8 Kidney enlargement,urate deposition is“spotted kidney”

3 结论

本试验从疑似呼吸型传染性支气管炎（IB）死鸡气管和肺脏组织中成功分离到一株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第5代,卷缩胚达到50%.第3～5代的尿囊液经1.5%胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集.琼脂凝胶扩散试验中,病毒分离得到的第3～5代鸡胚尿囊液与呼吸型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和呼吸型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合[12].该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对NDV LaSota株的增殖有显著干扰作用[13].动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达50%,死鸡的病理变化明显而典型.结果表明,该分离毒株是鸡呼吸型IBV[14].

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