热灼联合液氮冷冻建立兔中晚期股骨头缺血性坏死动物模型

李富强，宁亚功，张恩龙，徐文漭，李峻辉

1解放军总医院/军医进修学院，北京 100853；2成都军区昆明总医院，昆明 650032

股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)是临床常见的高度致残性疾病。该病病因不明，目前临床多以原发性和继发性[1]进行大致区分。建立理想的股骨头坏死动物模型，是进行股骨头坏死治疗研究的基础[2]。目前常用的激素型、乙醇型、液氮冷冻、微波灭活、截骨融合等模型的建立，与临床ANFH的病因和病理过程仍有很大差异。本实验在借鉴既往成功经验的基础上，旨在探讨中晚期(FicatⅢ-Ⅳ期)兔ANFH动物模型的建立，缩短造模时间，为中晚期ANFH的治疗研究提供一种合适的动物模型。

材料和方法

1 实验动物 5月龄日本大耳白兔20只，雌雄不限，体质量2.7-3.0kg，由昆明医学院动物实验中心提供。许可证号：SYXK(滇)2005-0008。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[3]。

2 药品与仪器 戊巴比妥钠，购自上海艾研生物科技有限公司；液氮，由昆明总医院供氧中心提供；可控温电烙铁，由昆明总医院医学工程科改制；双能X线骨密度检测仪，购自法国Medllink Osteocore3；核磁共振扫描仪，购自德国Siemens Verio 3.0T。

3 造模方法 取20只兔，左后肢用于造模，右侧对照。戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉注射麻醉后，以大转子体表标记点为中心，直径5cm备皮，取右侧卧位固定，常规消毒术野、铺洞巾，仍以大转子为中心在髋关节外侧沿股骨方向作长约3cm切口，于肌间隙逐层切开直达关节囊，环股骨颈切开关节囊，牵引股骨并内收暴露股骨头，显露股骨头负重区，注意保护股骨头韧带，防止髋关节脱位，预热电烙铁，当温度达100℃时电源自动断开，将烙铁头置于股骨头负重面持续2min，操作中注意保护周围组织，而后以液氮棉签连续快速冷冻股骨头25次，10s/次。自然复温后用0.9%氯化钠溶液清洗，逐层缝合术口。手术当日及术后3d术口周围肌肉注射青霉素80万U/d，预防感染。4 观察指标 1)一般情况：动物的精神状态、术口愈合情况、进食、排泄及造模侧肢体活动情况。2)X线、MRI：手术后观察髋关节、股骨头形态，骨密度及骨小梁变化，了解股骨头坏死情况。3)股骨头标本大体观察：关节囊变化，股骨头外形、颜色，关节面等情况。4)组织病理学观察：股骨标本放入4%甲醛溶液中固定，取出标本自来水冲洗3遍，放入10%硝酸水溶液中脱钙4-6h，直至针刺入组织无阻力感为止；乙醇梯度脱水后置于二甲苯中透明，标本浸蜡，包埋于蜡块。切片行HE(苏木素-伊红)染色。

结 果

1 一般情况 术后3d始所有实验动物精神恢复，进食、排泄正常，术口5d左右完全愈合，未发生髋关节脱位。术后4周左右大部分动物出现患肢活动受限，麻醉后被动活动患肢可感觉外展、后伸不同程度受限。

2 X线检查 造模1周后造模侧股骨头外形圆，骨密度无明显变化，骨小梁结构正常；2周时股骨头外形圆，骨密度稍增加，骨小梁结构完整，髋关节间隙模糊；4周时股骨头轻度变扁，表面欠光滑，有囊性结构形成，出现硬化带，骨小梁结构紊乱；6周时股骨头外形变扁，表面毛糙，骨密度明显增加，局部有轻度塌陷征象；8周时髋关节周围发生增生，股骨头变小，关节面塌陷。见图1。3 MRI检查 术后1周未见明显信号异常，关节腔内少量积液；术后2周可见坏死区在T1WI上为中低信号，在T2WI上呈较高信号，周围环绕线样低信号，毗邻区域可见骨髓水肿；4周为低信号围绕的信号不均坏死区，呈散在、点状分布于股骨头内；6周时股骨头脂肪高信号中出现不同形态的低信号区，呈环形、带状和灶状；8周时表现为骨性关节炎改变，间隙变窄，关节面骨质增生，边缘骨赘形成。见图2。

4 大体观察 造模1周后实验侧股骨头承重面失去了正常的淡粉紫色，呈灰白色改变，与正常组织之间有明显界限；2周后股骨头灰白色面积缩小，与正常组织之间界限模糊，关节面尚光滑；4周时股骨头稍变扁，关节软骨表面毛糙，部分出现剥脱；6周时股骨头明显变扁，关节软骨剥脱严重，关节面塌陷；8周时关节面进一步塌陷，股骨头变小，环塌陷区出现了明显的增生组织。见图3。

5 组织病理学观察 造模1周后关节软骨局部出现坏死，成骨区骨小梁排列基本正常，局部区域骨陷窝变空，骨细胞消失，髓腔内组织出现坏死；2周后关节面软骨变薄、结构不连续，部分区域变性坏死，软骨下方骨小梁纤细，排列紊乱，髓腔内片状骨髓造血细胞凝固性坏死及骨髓脂肪组织液化性坏死；造模4周后关节面软骨破坏加重，软骨下骨质出现修复迹象；6周后关节面软骨损害继续扩大，部分区域出现修复迹象，形成同源细胞群，未能修复区域由增生的纤维组织代替，软骨下骨小梁坏死、断裂，形成死骨，髓腔内纤维组织增生；造模8周后软骨进一步塌陷伴软骨下肉芽组织增生，成骨区骨小梁大片骨坏死及髓腔内纤维化。见图4。

讨 论

目前与ANFH有关的因素大约有60余种[4]，临床上大致可分为外伤性和非外伤性两大类[5]，外伤性主要是由于骨折或脱位导致股骨头供血血管损伤，直接导致骨缺血坏死；非外伤性病因的致病机制比较复杂，或为多种因素协同作用的结果。为寻求理想的治疗研究对象，前人对股骨头坏死动物模型的建立进行了很多探讨，主要以全身激素型和局部液氮冷冻型为主[6]，孔令擘[7]等对上述两种主要造模方法进行比较，认为激素的方法并非一定能引起股骨头坏死，而液氮冷冻方法建立的兔股骨头缺血坏死模型方法简便、坏死明显。且使用激素仅能复制早期的病理改变[8]。对实验动物的选择也非常广泛，朱建龙[9]等认为符合人类股骨头坏死病变的病理过程、模型有良好的可重复性、动物的解剖和生理特点尽可能与人类相似、经济可行是选择实验动物的原则，因此笔者选择兔作为实验动物。目前没有一种方法能够完全模拟人ANFH发病过程[10]，但只要模拟出病理过程中的某些重要特征也会对治疗研究产生意义。

图1 造模后1(A)、4(B)、8(C)周X线表现Fig 1 X-ray findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

图2 造模后1(A)、4(B)、8(C)周MRI表现Fig 2 MRI findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

图3 造模后正常侧与实验侧股骨头大体比较A：术后1周；B：术后4周；C：术后8周Fig 3 Gross findings in normal and experimental sides of femoral head at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

图4 造模后组织病理学观查A：术后1周；B：术后4周；C：术后8周Fig 4 Histopathological findings at weeks 1, 4, and 8 after operation

以往股骨头坏死保髋治疗的目标重在骨的固有病变，忽略了关节软骨的情况。本实验是模拟中晚期ANFH关节面塌陷、软骨破坏的病理过程，为中晚期股骨头坏死的治疗研究提供适宜的动物模型。本实验在以往常规液氮冷冻致股骨头坏死单因素造模的基础上，加入了促进股骨头软骨坏死、剥离的因素。范猛[11]等采用局部冷热交替损伤建立鸸鹋股骨头坏死塌陷模型，认为在造成骨坏死方面使用冷热交替的方式优于使用单纯冷冻的方式。朱晓松等[12]采用将微波天线插入兔股骨头内对股骨头灭活10min的方法成功造成股骨头坏死模型，通过实验得出最佳作业温度为55℃，本实验选择作业温度为100℃，一则是由于烙铁头置于股骨头软骨表面而非股骨头内，二则微波天线不适用于本方法操作，且电烙铁最低可调温度为100℃，温度再高可能会导致软骨下骨质的严重损伤、坏死面积无法控制。在软骨表面热灼的适宜温度今后还可进一步研究探讨。

在实验初期我们尝试对部分造模后的实验动物进行螺旋CT检查，结果造模后4周以前的动物股骨头在CT扫描下无特殊发现，而造模2周以后的动物在MRI扫描时股骨头内已有明显改变，霍现英[13]等研究表明MRI对于早期股骨头坏死的诊断最敏感、特异性高。因此本实验采用西门子公司3.0T磁共振仪扫描作为实验动物的重要造模评价，能够早期发现股骨头病变，同时结合X线检查，总体把握股骨头外形变化。

综上所述，热灼联合液氮冷冻法能够模拟出中晚期ANFH关节软骨破坏、软骨下骨质塌陷、骨性关节炎形成的病理过程，且具有造模时间短、动物死亡率低、造模成功率高的优点，可为中晚期ANFH的治疗研究提供适宜的动物模型。

1 肖正权.股骨头坏死病学［M］. 1版.北京：人民军医出版社，2007：63.

2 戴双武，丁帅，李章华，等. 液氮冷冻法制作兔股骨头坏死模型：可行，理想与可信［J］. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14（2）：276-279.

3 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见［S］. 国科发财字〔2006〕398号.

4 赵德伟.股骨头缺血性坏死的修复与再造［M］. 2版.北京：人民卫生出版社，2008：32.

5 马坤，顾建平.股骨头坏死动物模型制作方法的研究进展［J］.中国介入影像与治疗学，2009，6（3）：286-289.

6 邓冰，权毅，潘显明，等.液氮注射制作兔股骨头缺血性坏死模型实验研究［J］. 西南国防医药，2009，19（3）：264-266.

7 孔令擘，牛舜，杨重飞，等. 兔股骨头缺血坏死模型的建立研究及比较［J］. 第四军医大学学报，2009，30（2）：138-141.

8 吕维富，侯昌龙，鲁东，等. 采用经导管动脉栓塞术建立猪股骨头缺血性坏死模型［J］. 中国介入影像与治疗学，2011，8（5）：439-442.

9 朱建龙，赵红昌. 液氮冷冻法诱导犬股骨头缺血性坏死模型MRI影像与病理观察［J］. 中医正骨，2011，23（6）：21-24.

10 刘国柱，杨彤涛，韩建伟，等. 改良式液氮冷冻法制备犬股骨头坏死动物模型［J］. 南方医科大学学报，2009，29（8）：1602-1604.

11 范猛，汪爱媛，王玉，等. 局部冷热交替损伤建立鸸鹋股骨头坏死塌陷模型［J］. 中国医学科学院学报，2011，33（4）：375-381.

12 朱晓松，李彦林，耿承奎，等. 微波灭活兔股骨头坏死模型建立的实验研究［J］. 昆明医学院学报，2009，（3）：63-67.

13 霍现英，张玉祥，陈国忠，等. 股骨头缺血性坏死的MRI诊断［J］. 中国CT和MRI杂志，2005，3（1）：51-53.