内热针对大鼠软组织慢性损伤的影响

张文玉，高 谦，王 刚，王 飞，杨志丽

解放军总医院 康复医学科，北京 100853

慢性软组织损伤在临床上很常见，损伤后功能恢复一直是康复治疗的重点，因此要筛选出有效的治疗方案。软组织内热针(简称内热针)采用针芯电阻丝均匀加热，针身温度随加热时间波动小，针尖温度容易控制[1]。本实验通过观察内热针疗法对大鼠腓肠肌肌肉肌腱接头处慢性损伤后形态学变化和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的水平变化探讨内热针的治疗机制。

材料和方法

1 动物 清洁级Wistar大鼠(解放军总医院医学实验动物中心提供)27只，雄性，体质量200-350g。分笼饲养，国家标准同体混合饲料喂养，自由饮水。

2 仪器和试剂 软组织打击器自制。软组织内热治疗仪由南京理工大学研制，内热针针体长度为13cm，直径1.0mm，针柄长4cm，直径2.2mm，针尾为直径3mm的二相电源插头。BDNF试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。

3 慢性软组织损伤动物模型制作 参考Kami等机械冲击挫伤造模方法[2]，将大鼠称重编号，用10%水合氯醛以3ml/kg腹腔内注射，麻醉后俯卧位固定于鼠板上，大鼠后腿处理方法和软组织打击器对其砸伤方法参照参考文献[3]，双侧腓肠肌肌肉肌腱接头处进行慢性损伤造模。造模后不做任何处理，正常环境下常规饲养，15d后根据大鼠的行为步态观察和病理组织切片提示，形成慢性软组织损伤动物模型。标准见参考文献[4]。

4 动物分组和实验治疗 将27只大鼠随机分为正常对照组3只，损伤对照组12只、内热针组12只，内热针组又分为治疗3、7、14、28d四个时间点，每个时间点各3只，损伤对照组按以上时间点随机分组，每个时间点3只。每只大鼠取双侧后腿损伤组织，每个时间点标本为6个。正常对照组：常规饲养，不做任何处理。损伤对照组：造模成功后不予任何治疗，自然恢复。内热针组：将大鼠麻醉后固定于鼠板，双下肢穿刺部位常规消毒，用13cm的内热针从跟腱处距离腓肠肌0.5cm的位置，与腓肠肌平行方向刺入组织内3cm，针尾连接电源，加热温度设为43℃，加热20min[1,4]。

5 采样及指标测定 各时间点处死大鼠，逐层切开皮肤筋膜，取出腓肠肌肌肉肌腱接头处，用4%中性缓冲多聚甲醛固定标本24h，常规脱水，石蜡包埋、切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，观察组织在镜下形态学变化。免疫组化检测：标本处理制成石蜡切片同上，免疫组化实验严格按照试剂说明书进行。阳性为出现棕黄色颗粒，在光镜下(200倍)采集图片，对图片分析采用Image-Pro Plus图片分析软件测定各组织标本中阳性个数。

6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料-x±s表示，采用单因素分析、t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠腓肠肌肌肉肌腱接头处的光镜形态改变正常肌纤维呈长柱形，细丝状，沿肌肉长轴平行排列，肌腱排列致密，条纹清晰，与周围组织分界清楚；治疗3d时，内热针组和损伤对照组基本相似，肌纤维扭曲和肌浆疏松，偶见个别肌纤维呈小节段变性坏死，局部出现断裂，间质纤维组织增生伴淋巴细胞及浆细胞、巨噬细胞浸润，可见少许出血，肌腱排列紊乱，间隙变大，部分断裂；治疗7、14d时，损伤对照组肌纤维出现萎缩，部分嗜碱性增强，间质纤维增生，炎性细胞浸润，肌腱结构紊乱；内热针组为部分肌纤维胞体嗜碱性增强、间质纤维轻度增生伴大量淋巴细胞及浆细胞浸润，可见新生毛细血管形成，横向吻合枝增多，部分胞体形态较正常，肌腱排列稍紊乱，部分炎性细胞浸润；治疗28d时，损伤对照组肌纤维局灶萎缩，炎性细胞浸润，间质增生，形成瘢痕样组织；内热针组肌纤维形态逐步恢复正常，排列规整，局部炎性细胞浸润，肌腱排列致密，条纹较前清晰，大部分结构与正常形态相似(见图1)。

2 三组BDNF比较 正常对照组BDNF 8.5±1.8，损伤对照组和内热针组各时间点BDNF活性均高于正常对照组(P<0.05)，治疗3d，内热针治疗组与损伤对照组BDNF比较差异无统计学意义(P>0.05)，7、14d内热针组显著高于损伤对照组(P<0.05)，28d内热针组低于损伤对照组(P<0.05)，见表1。

图1 内热针组大鼠腓肠肌肌肉肌腱接头处组织HE光镜下形态学变化(×100)A：正常组肌肉肌腱接头处结构；B：内热针组治疗3d肌肉肌腱接头处；C：内热针组治疗14d肌肉组织；D：内热针组治疗14d肌腱组织；E：内热针组治疗28d后肌肉肌腱接头处Fig 1 Morphology of gastrocnemius muscle tendon in interior heat needle therapy group under optical microscope with HE staining A: normal junction of gastrocnemius muscle tendon; B:junction of gastrocnemius muscle tendon in interior heat needle therapy group 3d after treatment; C: muscle tissue in interior heat needle therapy group 14d after treatment;D: tendon tissue in interior heat needle therapy group 14d after treatment; E: junction of gastrocnemius mucle tendon interior heat needle therapy group 28d after treatment

表1 损伤对照组与内热针组不同时间点腓肠肌肌肉肌腱接头处BDNF表达量比较Tab 1 Expression of BDNF in junction of gastrocnemius muscle tendon at different time points between injury control group and interior heat needle therapy group(-x±s)

讨 论

脑源性神经营养因子(BDNF)是目前发现的活性很强的广谱营养因子，其对神经元和软组织均有显著的营养活性，可增进代谢，促进细胞存活[5-6]。BDNF分子是由119个氨基酸残基组成的分泌型碱性蛋白质，分子量为13.15kU，主要由β折叠和无规则结构组成，两个相同的BDNF分子以共价键形式结合形成活性二聚体，通过配体-受体结合方式，激活信号传导，发挥功能作用[7]。既往研究表明BDNF对维持神经细胞和软组织的存活以及引导细胞再生有重要意义，软组织损伤后BDNF表达上调，并且受神经活动及递质系统的调节，BDNF对损伤组织具有显著的修复功能[8-10]。本实验通过观察受损的腓肠肌肌肉肌腱接头处形态学变化和BDNF变化来说明组织修复情况，评价内热针的治疗效果，为临床治疗筛选优秀治疗措施。本实验发现，内热针组中组织形态学变化较快，恢复显著，提示组织恢复速度快；损伤对照组在3-28d BDNF表达随时间缓慢，持续性增加，说明组织不断在进行自我修复；内热针组3d时BDNF含量升高，但与损伤对照组间无明显差异(P>0.05)；7、14d，内热针组显著高于损伤对照组(P<0.05)，说明针刺加热治疗可明显促进受损局部BDNF表达，减轻组织变性坏死程度，加速恢复；28d，内热针组表达低于损伤对照组(P<0.05)，说明内热针组中组织恢复已进入后期或基本完成，提示内热针组可明显加快组织恢复进程，缩短组织修复所需时间。总之，针刺恒温治疗可提高BDNF表达，促进损伤组织生长修复。

慢性软组织损伤在临床上很常见，可因直接或间接顿戳伤引起，会明显降低生活质量。内热针疗法是以病变受损组织压痛点分布为依据，严格按照解剖对压痛点进行密集型针刺[3]，该疗法主要是利用针热传导性将热量导入组织深部，促进其恢复。这可能是内热针治疗可显著提高组织恢复能力的原因。本实验研究表明内热针疗法可改善组织局部微循环、促进炎性反应，加速受损组织修复速度，缩短组织恢复所需时间，但本实验只对损伤组织只进行了内热针治疗，未与其他治疗方法相比较，其治疗效果优劣有待进一步研究。

1 王飞，高谦，王刚，等. 软组织内热治疗针体外温度变化的特点分析［J］. 军医进修学院学报，2010，31（1）：78-79．

2 Kami K，Masuhara M，Kashiba H，et al. Changes of vinculin and extracellular matrix components following blunt trauma to rat skeletal muscle［J］. Med Sci Sports Exerc，1993，25（7）：832-840.

3 杨志丽，高谦，王刚，等. 软组织内热针与银质针对大鼠骨骼肌慢性损伤后SOD、MDA水平的影响［J］. 中华保健医学杂志，2011，13（1）：28-30.

4 李光华，刘宏鹏，周旭，等. 运动训练对坐骨神经损伤小鼠神经形态和功能恢复影响的研究［J］．中国康复医学杂志，2010，25（1）：23-26．

5 Junger H，Junger WG. CNTF and GDNF，but not NT-4，support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms［J］.Neuroreport，1998，9（16）：3749-3754.

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10 Griesbeck O，Parsadanian AS，Sendtner M，et al. Expression of neurotrophins in skeletal muscle：quantitative comparison and significance for motoneuron survival and maintenance of function［J］.J Neurosci Res，1995，42（1）：21-33.