热应激时奶牛淋巴细胞基因表达研究进展

文 / 兰欣怡 张 彬 罗佳捷

（湖南农业大学动物科学技术学院）

热应激会引起细胞周期调控点G1/S或G2/M的阻滞，剧烈的热应激还会诱导细胞凋亡。淋巴细胞凋亡率在冬季时最低，为0.44%，夏季高温可显著提高奶牛外周淋巴细胞的凋亡率，同时有研究数据显示，淋巴细胞的凋亡率并不是在热应激初期就上升，而是有明显的滞后效应，即在热应激初期牛舍温度为28.53 ℃时凋亡率上升不显著，而牛舍温度33.17 ℃时淋巴细胞凋亡率达到最高，为17.79%（p<0.01），在热应激末期（27.03 ℃）淋巴细胞的凋亡率有所下降，为5.53%（p<0.01）[1]。

1 金属硫蛋白与动物细胞应激

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是重要的生理活性物质，具有广泛生物学功能，尤以清除自由基、抗应激和调控细胞凋亡作用重要。MT是低分子量、富含半胱氨酸残基并与金属离子相结合的非酶蛋白质。辐射、创伤、束缚等多种应激因素均能诱导MT合成，肖定福等采用不同应激因子对小鼠作用，诱导肝脏合成MT，结果发现，创伤可在24 h内使MT诱导合成量迅速增高，但24 h后MT诱导合成量从222.86%很快下降到68.29%（相对未创伤组）[2]。因此MT在小鼠体内能快速解毒，同时有助于创伤愈合，提高细胞修复增殖速度。这可能与MT的抗氧化性能有关。张彬等采用125I标记金属硫蛋白（125I-MT），对MT在奶牛公犊体内吸收、排泄、存留和分布等代谢规律进行了研究，并证实MT对心肌、肝细胞等具有保护作用[3]。MT对重金属的解毒作用和抗氧化作用已被广泛接受，它在体内分布广泛，主要存在于胞质和核内，但其对细胞凋亡基因表达水平的影响还鲜见报道。

天然条件下，MT中的巯基均以还原状态存在，其中的金属具有动力学不稳定性，而巯基具有亲核性，从而使MT易与亲电性物质特别是某些自由基相互作用，可作为高效抗氧化剂清除自由基，降低自由基对细胞的毒害，增强机体应激反应能力[4，5]。MT的抗自由基作用是细胞保护的主要机制之一。损伤性刺激可诱导肝细胞内MT合成，给大鼠腹腔注射内毒素后，肝脏MT含量比对照动物增加62.6 倍，而脂质过氧化反应被明显抑制。MT能清除OH自由基，调节细胞内的氧化还原反应。张彬等探讨了外源性金属硫蛋白对奶牛抗热应激的调控作用，Zn-MT可显著提高奶牛血液中GSHPX和红细胞中SOD的活性，提高抗氧化酶SOD基因的表达水平[6]；2009年又研究了MT针对奶牛的泌乳性能和抗氧化状况，得出一系列成果[7]。据报道，MT清除OH自由基的能力是超氧化物歧化酶（SOD）的1 000 倍，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的100倍，MT对OH自由基引起DNA降解的保护作用比还原型谷胱甘肽（GSH）强800 倍[8，9]，因而在细胞和组织中起保护DNA降解，使蛋白质和脂类物质免遭氧化应激损伤的重要作用。MT所具有的调控细胞凋亡的功能主要是通过其抗氧化作用，提高ATP酶活性，保护线粒体的功能和抑制促凋亡蛋白的表达[10]，或通过影响Bcl-2家族蛋白（又称细胞凋亡调节蛋白）的表达而抑制应激引起的细胞凋亡[11，12]，或通过抑制线粒体Cytc的释放及细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化，进而抑制细胞凋亡而实现的[13]。MT能调节NF-κB的活性。NF-κB是调节炎性细胞因子、黏附分子、环氧合酶和NO合酶等基因表达的转录因子，在多数细胞中，NF-κB与它的抑制蛋白IκB结合，以无活性形式存在于胞质。TNF-α、IL-1和内毒素脂多糖等通过磷酸化和降解IκB使NF-κB转移入核，并激活靶基因转录。研究发现，细胞内氧化反应状态和活性氧也参与NF-κB活性的调节。MT在胞质可以抑制IκB的降解，从而阻止TNF诱导的NF-κB激活。MT还可能在核内与Zn结合，经调节锌指结构影响NF-κB与DNA的结合。作为NF-κB活性的负性调节因子，MT能减少炎症细胞因子的表达，从而起到细胞保护作用[14]。

2 RIP3在细胞内的定位

1995年，Stanger B Z等首次通过酵母双杂交发现了一个与Fas相互作用的蛋白，因而命名为受体相互作用蛋白（receptor-interacting proteins，RIPs）。RIP家族蛋白是一类Ser/Thr蛋白激酶，与IRAK（interleukin-1-receptor-associated kinase）家族蛋白关系密切。它们不仅在结构上都具有一段保守的激酶结构域（kinase domain，KD），而且在功能上很相似，许多细胞胁迫因子（如病原体感染、炎症反应、细胞分化、DNA降解等）都会引发细胞生存环境的改变，这些胁迫因子既有由细胞表面受体转导的胞外信号，也有由细胞内环境改变引发的胞内信号，RIP家族成员就在这些刺激状况下发挥重要作用。

RIP3过量表达能引发一种caspase依赖的细胞凋亡。该细胞凋亡的发生会依赖于IP3的C端，但不依赖于其激酶活性以及RIP3与RIP1相互作用的RHIM结构域。过量表达RIP3，并用TNF处理细胞后，发现缺失了C末端的RIP3（只剩N末端氨基酸1-436）会抑制TNF诱导的caspase的激活，但不影响TNF诱导的NF-κB信号通路，这提示RIP3的C末端在TNF诱导的caspase依赖的细胞凋亡途径中发挥着重要的作用[15]。Yang Y等在Hela细胞中过量表达RIP3，发现RIP3定位于胞质，并且可以在细胞质和核之间穿梭。他们同时在RIP3上定位出1 段非经典的核定位和3 段富含亮氨酸的核输出信号，分别为NLS（氨基酸442～472）、NES1（氨基酸255～264）、NES2（氨基酸344～354）、NES3Ⅰ（氨基酸116～126）和NES3Ⅱ（氨基酸121～131）[16]。其中NES1和NES2以CRM1依赖的方式介导RIP3出核，CRM1是一种主要的出核介导物，它与出核蛋白上的NES序列结合并将其转运至核孔的出核部位；NES3则不需要CRM1的协助。NES1和NES2在鼠源RIP3内的同源序列分别为氨基酸260～268和339～349[17]。Leptomycin B（LMB）是从链霉菌中分离出来的一种不饱和支链脂肪酸，其末端带有内酯环，它和CRM1的一个保守半胱氨酸巯基形成共价化合物，阻止CRM1和出核目标蛋白的NES序列相互作用，是一种有效的CRM1介导的出核转运的抑制剂。Hela细胞中外源表达的RIP3在LMB于37 ℃处理后，大多定位于细胞核内，说明RIP3是一个能够在核质间自由穿梭的蛋白质，其主要的核输出方式是CRM1依赖的，即通过NES1和NES2实现。RIP3上NLS（氨基酸442～472）的31 个氨基酸残基正是外源表达RIP3诱导凋亡的最小序列，Yang Y等据此推断RIP3诱导细胞凋亡的功能可能与定位相关，在TNF刺激下，外源RIP3借助内源RIP3共定位于TNF-R1信号复合体上，随后磷酸化RIP1，调控NF-κB的活化[16]。

3 细胞凋亡与热应激反应

细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。当暴露于各种理化及生物性刺激时，任何生物细胞（从细菌、酵母菌到高等动物细胞）都将出现一系列适应代偿性反应。这些反应包括与损伤因素有关的特异性反应和与损伤因素关系不大的非特异性反应，统称为细胞应激（cell stress）。在不同应激原作用下，生物细胞都可出现某些类似反应，如多种生物、理化应激原都可导致热休克蛋白表达增加。过去不少学者倾向于将此视为“非特异性反应”，但是，不同应激原作用下热休克蛋白表达的种类和水平差别依然很大。

热应激反应能促进中性粒细胞凋亡并减少活性氧释放。细胞受到不良因素刺激时，均可通过基因表达模式的改变而导致一系列称为热休克蛋白（HSPs）的合成，以维护细胞的结构和功能，并起着保护应激结果的作用。HSPs是热应激反应的标志性产物，其中HSP70最为重要，分布在各种细胞中，并具有广泛的保护作用。不同的组织细胞对同样的热休克具有不同的反应。如在小鼠整体热休克时（42 ℃，15 min，恢复24 h），心脏组织以诱导HSP70和HSP90α表达为主，而肝脏组织则以诱导HSP27/25为主。生物细胞暴露于高温（热休克）时所表现的以基因表达变化为特征的防御适应反应称为热休克反应（HSR）。许多研究表明，机体应激时，应激因素的刺激会引起细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤等多种反应，其中细胞凋亡可最大限度地减少机体非生理性细胞坏死，以减轻大量细胞坏死所致的毒副作用。冯建江等研究表明，热适应处理明显干扰热应激细胞的细胞周期进程。夏季持续高温容易对奶牛的生理机能造成影响，从而导致奶牛产奶量的下降[18]。据报道，夏季热应激会造成奶牛外周血淋巴细胞的凋亡率显著上升[1]。在热应激初期，动物可通过自身调节来减弱热应激反应，然而一旦超过自身调节的范围，淋巴细胞凋亡率则大大升高。在高温对奶牛乳腺上皮细胞凋亡试验中，凋亡率在处理后6 h达到高峰，而后逐渐降低，细胞凋亡率随热应激程度的不同而不断变化，也表现出细胞凋亡的滞后效应。蔡亚非等曾在高温对奶牛外周血淋巴细胞凋亡率影响的试验中同样发现细胞凋亡存在滞后效应。此外，在热应激下，处于不同细胞周期淋巴细胞比例也会发生变化[19]。

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