妊娠期糖尿病大鼠胎膜中水通道蛋白8mRNA的表达

刘广智 刘金梅 王志军 郭小丽 姚玉洁

妊娠期糖尿病是指妊娠期间首次发生或发现的糖耐量异常。研究发现，在人和多种动物胎盘和胎膜内有水通道蛋白的表达［1，2］，他们属于近年发现的一组选择性转运水的跨膜蛋白家族(称为水通道蛋白家族AQPS)的成员。本研究通过RTPCR法检测水通道蛋白8(AQP8)mRNA在妊娠期糖尿病大鼠胎膜中的表达情况，探讨糖代谢异常导致的羊水过多是否与AQP8基因的改变有关，为阐明糖代谢导致的水平衡紊乱的分子机制提供理论依据，同时也为这种因代谢异常导致的水平衡紊乱提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 造动物模型：选取健康成年SD大鼠，雌雄兼备，体重180～220 g，由北京华阜康公司提供，采用引导图片方法确定大鼠的动情周期，将处于动情前期的雌、雄鼠按1∶1合笼，次晨检查阴道口及垫料，观察是否有阴栓存在，有阴栓者定为怀孕第1天，分开雌、雄鼠。模型鼠于妊娠第5天一次性尾静脉注射链脲菌素(STZ)35 mg/kg，注射72 h后，测空腹血糖(FGB)，稳定在13.5 mg/L以上者为糖尿病模型造模成功，共30只，做模型组。选取30只正常妊娠大鼠做对照组。

1.1.2 标本采集：妊娠第19天于无菌条件下获取模型组和对照组大鼠胎膜组织大小1 cm×1 cm，DEPC水冲洗干净去除血液，滤纸吸去多余水分，立即放入液氮中，转运至-80℃保存。

1.1.3 主要试剂：RNA提取试剂Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司，逆转录酶(AMV-RT)、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)、Dntp、Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、随机引物(Random primers)均购自美国 Promega公司，DNA Marker为MBI Fermentas公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因及内参引物的合成：引物序列上游引物：5’ggt gga cac ttc aac cct gc-3’，下游引物：5’ggg ccc agc cag tag atc ca-3’，依据文献［3］设计，由上海生物工程公司合成。

1.2.2 细胞总RNA提取及完整性检测：取胎膜组织50 mg，加入1 ml RNA提取液(Trizol)，在冰浴匀浆器研磨后分装于2个EP管中，加入200 μl氯仿，震荡、多次离心后，将RNA提取液4 μl与上样缓冲液2 μl混匀，1.5%琼脂糖凝胶(含 EB)电泳分离，凝胶呈像系统观察结果，可见5、18、和28 s 3条带，表明RNA无降解。

1.2.3 提取RNA，用756型紫外分光光度计测量 OD260/OD280比值，定量分析RNA含量。合成cDNA，PCR扩增目的基因和β-actin用作内参照。

1.2.4 RT-PCR产物分析：用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用完全随机设计的单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组AQP8 mRNA表达情况 AQP8 mRNA在428 kD上有条带出现，在对照组和模型组孕鼠胎膜中均有表达。见图 1、2。

图1 AQP8 mRNA在妊娠期糖尿病大鼠胎膜中的表达

图2 AQP8 mRNA在正常孕鼠胎膜中的表达

2.2 2组AQP8 mRNA/β-actin的IOD值比较 模型组AQP8 mRNA/β-actin mRNA明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 2组大鼠AQP8mRNA/β-actin的IOD值n=30，±s

表1 2组大鼠AQP8mRNA/β-actin的IOD值n=30，±s

组别 AQPs/β-actin IOD值 F值 P值0.6562±0.0451 1.1073±0.1494 8.362 ＜0.05模型组对照组

3 讨论

羊水的胎膜内吸收即羊水通过胎盘胎儿面的绒毛膜羊膜跨膜转运到胎儿血循环中，又称膜内转运途径。最近大量研究证明羊水膜内吸收是调节羊水平衡的根本因素之一［2，4，5］。动物实验表明，羊水通过绒毛膜羊膜的通透性，远大于羊水以简单扩散方式通过细胞膜的脂质双分子层。这种绒毛膜羊膜跨膜转运途径是通过存在于绒毛膜羊膜中的功能性水通道蛋白(aquaporin AQP)来实现的［4］。

水通道蛋白广泛分布于机体组织细胞中，主要介导水分子及其他小分子的跨膜转运。AQP表达或功能的改变不仅对水分子的转运产生影响，也与许多水代谢性疾病有关，其参与母-胎间的液体交换，与羊水的形成、成分及羊水量有关［6］。妊娠期糖尿病患者表现为明显的水代谢紊乱，大约有10%左右的妊娠期糖尿病会伴随羊水量的异常，表现为羊水过多［6］。在其胎盘、胎膜中是否存在有AQP的表达和功能变化，以及这些变化是否与妊娠期糖尿病的发生发展有关，值得关注。

目前发现的水通道蛋白亚型主要为 AQP1、3、4、8、9。有研究发现，AQP8在人和羊的胎盘、羊膜、绒毛膜上均有表达［7］。研究表明，AQP3和AQP8人和羊胎盘的滋养细胞上表达，且在羊胚胎的发育过程中，AQP的表达高峰与羊水最大循环量的时期一致［8］。张睿等［9］用RT-PCR方法证实了正常足月妊娠的羊膜和绒毛膜上AQP1、3、8、9均有表达，提示他们都是介导羊水通过膜内途径重吸收的重要通道，在羊水量和成分的平衡调节中发挥作用。同时，国内外许多研究也提出了其他几种水通道蛋白亚型可能参与各种水代谢紊乱。

本研究通过RT-PCR技术对比了水通道蛋白在正常孕鼠及GDM大鼠胎膜上的表达差异，表明AQP8在正常孕鼠及GDM大鼠胎膜上均有表达，其在妊娠期糖尿病胎膜上较正常孕鼠胎膜上表现为表达明显减弱。推测AQP8缺失可能导致羊水量增多，渗透压增高，糖代谢异常导致的羊水过多可能与AQP8的基因量或其结构改变有关，AQP8可能参与了妊娠期糖代谢异常时的水平衡紊乱或为水平衡紊乱的代偿性反应。

总之，水通道蛋白8mRNA在正常孕鼠及模型组大鼠胎膜中均有表达，且在模型组的大鼠胎膜上的表达水平明显低于对照组，胎膜中水通道蛋白的分子结构、表达的强弱以及在细胞中的分布位置共同参与羊水的动态平衡。

1 Johnston H，Koukoulas L，Jeyaseelan K，et al.Ontogeny of aquaporins 1 and 3 in ovine placenta and fetel membranes.Placenta，2000，21：88-99.

2 Mann SE，Rice EA，Yang BA，et al.Expression and localization of aquaporin 1 and 3 in human fetal membranes.Am J Obstet Gynecol，2002，187：902-907.

3 Wang S，Chen J，Au KT，et al.Expression of aquaporin 8 and its up-regulation by cyclicadenosine monophosphate in human WISH cells.Am J Obstet Gynecol，2003，188：997-1001.

4 Shioji M，Fukuda H，Kanzaki T，et al.Reduction of aquaporin-8 on fetal membranes under oligohydramnios in mice lacking prostaglandin F2 alpha receptor.J Obstet Gynaecol Res，2006，32：373-378.

5 Edashiqe K，Ohta S，Tanaka M，et al.The role of aquaproin 3 in the movement of water and cryoprotectants in mouse morulae.Biol Reprod，2007，77：365-375.

6 Beall MH，Wang S，Yang B，et al.Placental and membrane aquaporin water channels：Correlation with amniotic fluid volume and composition.Placenta，2006，24：1-8.

7 Wang S，Su Y，Fang R，et al.Cloning and expression of aquaporin 8 water channel in ovine and human chorioamiotic membranes：molecular mechanism of the intramembranous pathway for amniotic fluid resorption(abstract).J Soc Gynecol Investig，2000，7：183A.

8 Shengbiao W，Jiexiong C，Bing H.Cloning and cellular expression of aquaporin 9 in ovine fetal membranes.Am J Obstetr Gynecol，2005，193：841-848.

9 张睿，杨东梓，刘颖琳，等.水通道蛋白-1、3、8、9mRNA在人胎膜中的表达.南方医科大学学报，2007，27：702-704.