Skp2和p27蛋白在骨肉瘤中的表达及临床意义

廉红星 赵敏 刘瑞吉

骨肉瘤(ostcosarcoma)是最常见的骨原发性恶性肿瘤，约占所有骨肿瘤的20%，常发生于青少年，一般预后较差，且易早期发生肺转移。故骨肉瘤给患者本身、患者家庭以至社会都带来了问题，对临床诊治提出了挑战。我们采用免疫组织化学SP法，观察了Skp2、p27蛋白在骨肉瘤组织中的表达情况，并分析了两者与肿瘤的发生、发展及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 35例骨肉瘤选自2000年1月至2007年12月我院病理科存档标本蜡块，其中骨肉瘤男22例，女13例，男女比例1.7∶1;年龄11～55岁，平均年龄21岁。骨肉瘤临床分期参照Enneking分期标准，Ⅲ期12例，Ⅱa 5例，Ⅱb 18例，其中肺转移者24例。全部病例均获随访。另外选取14例骨软骨瘤作为对照研究。

1.2 实验方法 4μm厚度石蜡切片，60℃烤片3 h，SP法免疫组化染色技术参照福州迈新公司介绍的SP法步骤操作，用苏木素液复染细胞核，盐酸酒精分化，水洗返蓝，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封固切片。用磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。

1.3 结果判定 Skp2和p27蛋白免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色和(或)棕褐色颗粒，Skp2定位于细胞核或细胞浆上，p27蛋白主要定位于细胞核上。每张切片选取10个高倍视野(×400)观察阳性细胞占细胞总数的百分比，无阳性细胞者为阴性(－)，＜50%细胞着黄色或者＜30%细胞着棕黄色者为阳性(+)，＞50%细胞着黄色或者＞30%细胞着棕黄色者为强阳性(++)。染色阳性及强阳性合并为染色阳性组，与染色阴性组比较。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性分析用Spearman等级相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 Skp2蛋白染色主要表达于细胞核或细胞浆内。Skp2蛋白在骨肉瘤中阳性表达率为74.3%(26/35);而在骨软骨瘤中阳性表达率为11.4%(4/14)，两者比较差异有统计学意义(χ2=8.803，P=0.003)。见表1。p27蛋白染色主要表达于细胞核上。p27蛋白在骨肉瘤中阳性表达率为40.0%(14/35);而在骨软骨瘤中阳性表达率为78.6%(11/14)，两者比较差异有统计学意义(χ2=5.954，P=0.015)。见表2。

表1 Skp2蛋白在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中的表达 例

表2 p27蛋白在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中的表达 例

2.2 Skp2和p27表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 Skp2蛋白在骨肉瘤组织中的表达与Enneking分期、肺转移密切相关(P ＜0.05)，而与性别、年龄无关(P ＞0.05);Skp2蛋白在骨肉瘤组Enneking外科分期Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ期阳性表达率分别为60.0%、66.7%、91.7%，Ⅲ期骨肉瘤的 Skp2 蛋白的表达强度与Ⅱa期、Ⅱb期相比差异有统计学意义(P＜0.05)，而Ⅱa期与Ⅱb期的骨肉瘤的Skp2蛋白的表达强度差异无统计学意义(P＞0.05)。p27蛋白在骨肉瘤组织中的表达与Enneking分期密切相关(P＜0.05)，而与性别、年龄、肺转移无关(P ＞0.05);p27蛋白在骨肉瘤组 Enneking外科分期Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ期阳性表达率分别为60.0%、50.0%、16.7%，Ⅲ期骨肉瘤的 p27蛋白的表达强度与Ⅱa期、Ⅱb期相比差异有统计学意义(P＜0.05)，而Ⅱa期与Ⅱb期的骨肉瘤的Skp2蛋白的表达强度差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

2.3 Skp2和p27在骨肉瘤中表达的相关性 在35例骨肉瘤标本中有7例(20%)Skp2和p27的表达同时呈阳性，2例(5.7%)同时呈阴性;26例(74.3%)Skp2和p27的表达呈不一致性。Skp2和p27在大肠癌中的表达呈负相关(r=－0.454，P=0.006) 。见表 4。

3 讨论

Skp2基因是1995年由Zhang等［1］通过荧光原位杂交发现的一个与细胞周期调控密切相关的基因，其定位于人5号染色体短臂上(5p13)，分子量为45 kD。Skp2在许多细胞周期调控因子的泛素依赖性蛋白水解途径中起到特异性识别底物的作用，从而参与细胞周期的调控。目前，已有许多细胞周期调控蛋白被证明通过Skp2依赖性泛素一蛋白酶途径降解，其中包括cyclinDI、cyclinE、CDK抑制因子 p27，转录因子 E2F及 p53等。研究发现Skp2特异识别p27，通过泛素-蛋白酶体途径降解p27［2］。在有丝分裂因子的刺激下，Skp2可下调P27，促进细胞由G1期进入S期，从而促进细胞的增殖，导致肿瘤的发生。

表3 Skp2和p27表达与骨肉瘤临床病理特征的关系例(%)

表4 Skp2和p27在骨肉瘤中表达的相关性 例

p27基因(p27kip1)是1994年由Polyak等［3］首次发现的一种广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，其定位于人染色体12p13，含两个外显子和两个内含子，cDNA长594bp，编码198个氨基酸。p27通过与CDK或Cyclin-CDK复合物的结合，实现对CDK活性的抑制，从而对细胞周期进行负调控。p27主要抑制G1/S的关键酶的活性，使细胞增殖停止在G1期，对细胞周期起负性调控作用，当肿瘤细胞受到癌生长信号刺激时，P27水平降低促进G1期的进展，增加细胞增殖的速度，促进肿瘤的发生发展［4］。

本研究显示:Skp2在骨肉癌中呈高表达，其阳性率为(74.3%)，明显高于骨软骨瘤(11.4%)，其差异有统计学意义(P＜0.05)。p27蛋白在骨肉瘤中阳性表达率为40.0%，而在骨软骨瘤中阳性表达率为78.6%，且Skp2与P27表达呈负相关(P ＜0.05)。这与 Wang 等［5，6］的报道相一致，提示在肿瘤发生过程中，Skp2表达的上调可能通过泛素-蛋白酶体途径导致P27表达减少，使其不能有效发挥细胞周期负调控因子的抑癌作用，使癌细胞具有更高的侵袭转移能力。本研究还发现Skp2蛋白在骨肉瘤组织中的表达与Enneking分期、肺转移密切相关，p27蛋白在骨肉瘤组织中的表达与Enneking分期密切相关，且临床分期越高，Skp2的表达阳性率越高，而p27表达阳性率越低，这与Veillard等［7］的研究结果一致，表明Skp2和p27在肿瘤中的恶性转化及癌细胞的转移过程中可能起重要作用。

1 Zhang H，Kobayashi R，Galaktionov K，et al.pl9Skpl and p45Skp2 are essential elements of the cyelin A － CDK2 Sphase kinase.Cell，1995，82:915-925.

2 Tsvetkov LM，Yeh KH，Lee SJ，et al.p27(Kip1)ubiquitination and degradation is regulated by the SCF(Skp2)complex through phospho-rylated Thr187 in p27.CurrBiol，1999，9:661-664.

3 Polyak K，Lee MH，Erdjument-Bromage H，et al.cloning of p27Kipl，a cyclin-dependent kinnse inhibitor and a potentialmedia tor of extmceIlular antimitogenic signals.cell，1994，78:59-66.

4 Slingerland J，Pagano M.Regulation of the CDK inhibitor P27 and its deregulation in cancers.JCell Physiol，2000，183:10-17.

5 Wang XC，Wu YP，Ye B，etal.Suppression of anoikis by SKP2 amplification and overexpression promotesmetastasis of esophageal squamous cell carcinoma.Mol Cancer Res，2009，7:12-22.

6 杨进，尹邦良，徐朝军，等.Skp2和P27在食管鳞状细胞癌中表达及其临床意义.现代生物医学进展，2010，10:4015-4018.

7 Veillard NR，Kwak B，Pelli G，et al.Antagonism of RANTES receptor reduces atherosclerotic plaque formation in mice.Circ Res，2004，94:253-261.