南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE－L硝酸还原酶基因的生物信息学分析

林敏卓，刘晨临，黄晓航，杨平平

（1.山东轻工业学院 食品与生物工程学院，山东 济南 250353；2.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛 266061；3.国家海洋局 海洋生物活性物质重点实验室，山东 青岛 266061）

硝酸盐是许多海区浮游植物中氮的主要来源，经浮游植物吸收后，在体内经过一系列酶的还原作用，最终转化成为氨氮后合成其他有机物质［1－2］。存在于细胞质的硝酸还原酶（NR）是氮素同化作用中的限速酶［3］，可直接调节硝酸盐还原，从而调节氮代谢，处于植物氮代谢的关键位置，其活力的大小直接影响了硝酸盐的生物利用度，在海洋生态系统氮循环过程中占有极其重要的地位。

高等植物的NR是由相同亚基组成的二聚体，每个单体含有1条100kDa的多肽和3个辅助因子，即FAD，细胞色素和钼辅因子（MoCo）。每个辅助因子相当于1个氧化还原中心。NR分子中电子的传递途径为：NAD（P）H＋H＋→FAD→细胞色素→MoCo→硝酸盐［4］。

2000年Yamasaki等［5］首次证实，在pH7.0的离体条件下，玉米诱导型硝酸还原酶（inducible NR，iNR）具有以NADH作为电子供体，催化亚硝酸盐的单电子还原合成一氧化氮（NO）的能力；Zhao等人［6］对拟南芥的NR野生型和缺陷性突变株研究表明，通过NR蛋白的积累，依赖于NR的NO合成对拟南芥的冷适应有很重要的作用。

目前，有关NR的研究主要集中在近海有关的浮游植物方面，对极地多样化的浮游植物群落的相关研究开展的还很少。南极地区具有独特的地理及气候特征，严酷的极地环境造就了生活在海冰环境中的真核光合微藻（冰藻）独特的生物学特性。在南极海冰的形成、生长和融化的季节性变化中，冰藻也经受了温度、光照等生态条件的剧烈变化。为数不多的研究报道表明，南极冰藻NR的结构和酶活特征与常温浮游植物的存在明显差异：Rigano等［7］比较了温度对南极嗜冷单细胞藻（KoliellaAntarctica）和常温藻（Chlorellasorokiniana）的NR酶活的影响，发现嗜冷藻最适酶活温度为15℃，在10℃时仍能保持77%的活性。

南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）是分离自南极海冰中的一种单细胞绿藻，对低温、高盐等逆境具有很强的适应能力。衣藻生活的海冰盐囊的盐浓度可达海水盐浓度的5倍，同时承受着低至－25℃的低温胁迫［8］。通过室内培养南极冰藻研究发现，其最适生长温度在4～10℃左右，最高生长温度不超过15℃，培养液置于－20℃冰箱保存，不影响其活力，在5倍正常海水盐度的条件下（150‰），仍然能够正常生长，目前还没有冰藻最低生长温度的报道。

本研究通过对克隆到南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR基因的序列测定和生物信息学分析，旨在通过与其它藻类进行比较分析，为南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的抗冻机制和NR基因功能的研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）由中国极地研究所（上海）提供，在南极中山站（69°S，77°E）附近浮冰中分离得到。藻种接种于灭菌海水配置的Provasoli培养基，培养条件为7℃，1 300～1 600lx和12L／12D。

南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR基因序列来自于本实验室构建的南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）cDNA文库，测序由上海桑尼生物技术有限公司代为执行。

1.2 NR基因的生物信息学分析

NR基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）分析通过 NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）进行操作，用DNAStar软件包中的EditSeq软件预测蛋白的理论分子量和等电点。通过SWISS－MODEL［9－11］（http：∥swissmodel.expasy.org／）网站预测 NR蛋白的三级结构。

将测定的NR序列用BLAST软件与GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中已知的其他NR序列进行比对。选取相似性较高的序列［12］用BioEdit软件进行对位排列，人工校正和合并序列。用MEGA 4.0［13］软件分析中的紧邻法（neighbor－joining method，NJ），构建系统发育树，通过自展检测法（bootstrap test）估计所构建的系统发育树的可靠性，重复次数为1 000次。运用MegAlign软件将ICE－L的NR基因和其它4个遗传距离较近的绿藻NR基因进行氨基酸序列同源性分析。

2 结果与分析

2.1 NR基因的序列分析

测序分析表明，该基因全长为3 053bp，含有1个完整的开放阅读框，编码863个氨基酸。预测该基因编码的蛋白的理论分子量为96.11kDa，等电点为6.42。

将预测的NR氨基酸序列进行Protein Blast分析发现其含有与钼辅因子、细胞色素b5和FAD功能域相似的序列（图1）。

图1 Blast分析NR基因可能含有的功能域Fig.1 The functional domains of NR gene predicted by Blast analysis

2.2 NR的系统发育分析

通过对南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR氨基酸序列的系统发育分析（图2）可以看出南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR基因与绿藻中的团藻、莱茵衣藻，杜氏盐藻和小球藻等绿藻的亲缘关系最近，其次是硅藻中的三角褐指藻和海链藻，以及红藻中的江蓠。

图2 NR的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of NR genes

2.3 NR的氨基酸序列同源性分析

运用MegAlign软件将南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列和4种绿藻的氨基酸序列进行同源性比对并研究了其活性位点（图3，其中，黑体字表示各亚基的起始位点；普通字体加下划线表示不同NR中起关键作用的保守氨基酸序列；黑体加下划线表示不同NR中起关键作用的氨基酸序列中氨基酸残基的差异），从分析结果可看出南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）与其他4种绿藻的各功能域的氨基酸序列之间还是有一些明显的差异，南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）与团藻、莱茵衣藻，杜氏盐藻和小球藻的同源性依次分别为63%，61%，60%和54%。

图3 南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）NR和4种不同NR氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homological analysis of amino acid sequence carried out for ICE－L NR and other 4types of NRs

2.4 NR基因的蛋白质三级结构预测分析

将南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列提交到SWISS－MODEL预测分析，发现其存在3段不同的功能域序列（表1），其三级结构预测如图4所示，其中，A，B，C分别为不同肽段所对应的预测模型。

由表1可见，所预测的南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列含有的3段不同的功能域，与上述Blast分析的结果相一致。

表1 预测南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）硝酸还原酶所含3个肽段的信息Table 1 Information about the predicted three peptides of the ICE－L nitrate reductase

图4 预测南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）硝酸还原酶所含三个肽段的三级结构图Fig.4 The predicted 3Dstructures of the ICE－⇑L nitrate reductase

3 讨 论

对不同物种的研究发现，不同生物的硝酸还原酶的亚基组成和分子量变化很大［14］：小球藻（Chlorella vulgaris）的硝酸还原酶由4个分子质量为90kDa的亚基组成，布朗纤维藻（Ankistrodesmusbraunii）则是由8个分子质量为60kDa的亚基组成，链孢囊（Neurosporacrassa）和黏红酵母（Rhodotorulaglutinis）均含有2个分子质量分别是115kDa和118kDa的亚基，膝沟藻（Gonyaulax）的硝酸还原酶由6个分子质量为52kDa的亚基组成。海洋硅藻中的硝酸还原酶在分子质量上与高等植物相近，大约为95～120kDa。但是甲藻中硝酸还原酶的组成基团的分子质量远小于该值，只有52kDa。通过核酸序列推断南极冰藻的硝酸还原酶单一亚基的分子量为96kDa，与已报道的绿藻该酶的分子量相近。

多个物种的NR氨基酸序列比对分析表明，南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR和几种绿藻NR的同源性比较高（平均为59.5%）。系统发育树分析显示，南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR与绿藻NR的进化距离较近，与高等植物和真核菌NR的距离较远。蛋白质功能预测分析显示，南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR含有与高等植物NR相类似的3个不同的功能结构域，分别为：FAD，细胞色素和钼辅因子。从这一结果来看，南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR与绿藻的NR相类似。

已有的一些研究表明，藻类的硝酸还原酶特性会因藻种的不同而存在差异，进而导致了藻类对硝酸盐利用效率的差异。南极冰藻NR具有有别于常温藻活性特征。Gao等［16］发现南极海链藻（Thalassiosiraantarctica）和南极棕囊藻（PhaeocystisantarcticaVona）的NR酶活的最适温度相比较于常温藻的更低。Vona［15］和 Rigano等［7］通过对南极冰藻（Koliellaantarctica）和小球藻（Chlorellasorokiniana）的硝酸还原酶活性的比较研究发现，不同来源藻类的NR适应的温度范围不同，冰藻K.antarctica的NR具有比C.sorokiniana的NR有更好的冷适应性和低温下更高的酶活特性。

南极衣藻对逆境所表现的强大的耐受力使其成为植物抗逆机制研究的理想材料，从南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）中克隆到的NR序列，是目前唯一一条有报道的南极冰藻NR基因序列。通过对南极衣藻南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）与其他物种的生物信息学的比较研究分析：一方面，可以为南极衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）中NR的功能和酶学的深入研究提供参考；另一方面，为南极衣藻在抗冻机制上的研究提供参考。

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