血液透析患者骨保护素基因多态性与骨密度关系的研究＊

肖海清，何计南

（湖南师范大学第一附属医院肾内科，长沙 410005）

肾性骨病（renal osteodystrophy，ROD）是一种多病因性疾病，一般认为，骨量减少是环境因素和遗传因素共同作用的结果。许多骨代谢相关基因被证实和密度、骨转换水平及骨质疏松的发生有关，骨保护素基因（Osteoprotegerin，OPG）被认为是调节骨量的一个候选基因，它与核转录因子－κB受体活化因子配体（receptoractivator of NF－κB ligand，RANKL）和核转录因子－κB受体活化因子（receptor activator of NF－κB，RANK）组成的分子调控系统是体内维持骨代谢平衡的分子基础。本研究对OPG基因进行单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）研究，并分析其与维持性血液透析患者骨密度（Bone mineral density，BMD）的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年6月至2010年6月湖南省某院肾内科维持性血液透析治疗患者112例为研究对象，维持透析3个月以上，每周2～3次，每次4～4.5h，研究对象均知情同意。

1.2 MALDI－TOFMS检测 采集血液透析组（透析前）空腹12h后外周静脉血，提取基因组DNA；选择OPG单核苷酸多态性位点共48个：选择条件为其最小等位基因频率大于0.15；进行引物设计与合成，PCR引物和单碱基延伸引物都是用Assay Designer（Sequenom）软件包设计，基因型检测最终结果由MassARRAY RT软件系统实时读取，并完成基因分型分析。

1.3 BMD测定 采用双能X射线吸收仪（DXA）测量受试者腰椎后前位L1～L4、左侧股骨颈、远端前臂1／3处BMD。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示。应用χ2检验分析Hardy－Weinberg平衡吻合度检验，不同基因型间BMD及骨代谢生化及调节因子OPG、RANKL等指标比较采用单因素方差分析以及协方差分析，进一步两两之间比较采用LSD法。运用logistic回归分析各基因型骨量减少和骨质疏松发生的危险因素。

2 结 果

OPG基因各多态性位点基因型和等位基因频率分布见表1，各基因型BMD比较见表2，骨质疏松危险因素的Logistic回归分析见表3，不同SNP基因型的骨生化指标和血清OPG、RANKL水平见表4。

表1 OPG基因各多态性位点基因型和等位基因频率分布

表2 OPG基因各多态性位点各基因型BMD比较（±s）

表2 OPG基因各多态性位点各基因型BMD比较（±s）

＊：P＜0.05，与AG、GG组比较，#：P＜0.05，与GG、GC组比较。

BMD（g／cm2）SNPs 基因型L4 rs11573928 AA 0.99±0.10＊左侧股骨颈 远端前臂1／3处 腰椎后前位L1～0.48±0.81 0.99±0.60 AG 0.75±0.76 0.47±0.73 0.85±0.24 GG 0.82±0.13 0.54±0.16 0.94±0.20 rs2073618 GG 0.83±0.14 0.52±0.09 0.93±0.19 GC 0.76±0.09 0.52±0.19 0.82±0.18 CC 0.91±0.11 0.43±0.21 1.20±0.21#

表3 骨质疏松危险因素的logistic回归分析

表4 不同SNP基因型的骨生化指标和血清OPG、RANKL、BGP、PTH水平（±s）

表4 不同SNP基因型的骨生化指标和血清OPG、RANKL、BGP、PTH水平（±s）

BGP：骨钙素；PTH：甲状旁腺激素。

SNPs 基因型 OPG（ng／mL） RANKL（ng／mL） BGP（ng／mL） PTH（ng／L）rs11573928 AA 72.24±28.81 140.73±155.18 0.82±0.32 511.13±292.81 AG 116.42±81.78 81.85±100.71 1.41±1.14 381.69±279.09 GG 78.79±68.22 72.20±120.97 1.36±1.07 398.64±299.87 rs2073618 GG 91.13±66.20 72.03±105.51 1.32±1.07 361.13±249.13 GC 86.69±61.93 69.22±117.23 1.25±0.78 374.40±303.17 CC 94.95±99.79 145.07±165.15 1.84±1.69 645.21±344.26

2 讨 论

OPG属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有抑制破骨细胞形成、分化、存活、活化并诱导其凋亡的功能，OPG基因敲除小鼠表现出严重的骨质疏松［1］，而OPG基因过度表达则导致骨质硬化［2］。本研究采用 MALDI－TOFMS技术共检测了OPG基因48个多态性位点基因型，初步发现rs11573928和rs2073618两个位点，在血液透析患者不同基因型之间BMD比较差异有统计学意义，考虑到所检测标本的OPG基因多态性位点多，工作量较大，本研究只选用了初步发现有意义的上述两个多态性位点做更进一步的研究探讨。

本研究检测到的OPG基因rs11573928位点包括AA、AG、GG 3种基因型，其基因型频率分别是4.2%、27.1%和68.7%。在左侧股骨颈部位，AA型BMD显著高于GG或AG型，而腰椎后前位L1～L4、远端前臂1／3处各基因型间BMD比较差异无统计学意义，可以推测AA型对血液透析患者骨量的维持可能具有一定的保护作用，但国内外暂尚无相关文献报道此多态性位点各基因型与BMD有关联，还有待进一步研究分析。rs2073618位点也存在3种基因型GG、GC、CC，这使该外显子的第3个氨基酸由赖氨酸Lys（AAG）变成了天冬酰胺Asn（AAC），这一多态性与国内外报道的位点相一致［3－4］，即G1181C位点。血液透析透患者该位点基因型频率GG基因型发生频率最高，CC型发生频率最低。CC型患者腰椎后前位L1～L4BMD明显高于GC或GG型，从结果上来看，左侧股骨颈部位、远端前臂1／3处CC型患者BMD均大于GG型和GC型，但是各基因型间BMD差异无统计学意义，此研究结果与国内外许多文献报道相似。Arko等［5］研究中证明G1181C是惟一与BMD相关的SNP位点，GG型患者腰椎BMD较GC型低，GG基因型是骨质疏松发生的危险因素。Langdahl等［3］在一项对丹麦绝经后女性的研究中发现，骨质疏松患者G等位基因频率较高，含有G等位基因（GG＋GC型）的个体腰椎BMD较CC型者低。而爱尔兰及日本绝经后女性人群中，携带 C等位基 因 者 BMD 最 低［6］。Ueland等［7］和 Vidal等［8］研究却并未发现其与骨量及骨折的相关性。本研究所观察的血液透析人群中，rs2073618位点CC型腰椎BMD显著高于GC型和GG型，即携带G等位基因的个体腰椎BMD低下，这说明OPG基因rs2073618位点CC型对血液透析患者腰椎BMD可能具有一定的保护作用。

本研究显示，在腰椎后前位L1～L4，除了年龄和血钙水平此类传统已知危险因素外，OPG基因rs2073618位点多态性是血液透析患者发生骨量减少和骨质疏松的危险因素，GG型患者发生骨量减少和骨质疏松的危险性显著升高，提示OPG基因rs2073618位点多态性与血液透析患者骨量变化存在一定的关联，等位基因C可能是血液透析患者腰椎BMD的保护因子。本研究推测OPG基因rs2073618多态性是否同样影响血液透析患者的骨转换？通过检测血清BGP、PTH、OPG和RANKL等骨代谢及调节因子指标水平，分析不同基因型之间这些指标的差异，结果发现就整个血液透析人群而言，OPG、RANKL、PTH水平均是增高的，但在不同基因型之间这些指标差异无统计学意义，这与文献研究结果一致［3－4］，提示OPG基因rs2073618多态性对血液透析患者骨量的作用并不是单纯通过影响上述这几个反映骨代谢的生化指标以及细胞因子达到的，尽管国外有研究认为OPG可以通过介导PTH对骨的转运作用而调节骨代谢。

综上所述，OPG基因rs11573928、rs2073618多态性可能在血液透析患者肾性骨病（ROD）的发病中有一定作用，它可能是骨量丢失的影响基因，似可作为发生ROD危险性的遗传标志及早期防治的候选基因之一。在临床上，可以通过检测患者OPG基因多态性分布，预测其ROD的发病、发展和预后情况，及时采取补钙及骨化三醇制剂等预防措施，有效地防治和减慢ROD进程，改善患者生活质量，提高患者生存率。ROD的病因和病理生理机制是复杂多样的，不是单一OPG基因多态性可以解释的，对于OPG基因多态性在ROD发病机制中的作用还有待进一步探索。

［1］ Bucay R，Sarosi I，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin－deficient mice develop early onsetosteoporosis and arterial calcification［J］.Genes Dev，1998，12（9）：1260－1268.

［2］ Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density［J］.Cell，1997，89（2）：309－319.

［3］ Langdahl BL，Carstens M，Stenkjaer L，et al.Polymorphisms in the osteoprotegerin gene are associated with osteoporotic fractures［J］.J Bone Miner Res，2002，17（7）：1245－1255.

［4］ 赵红燕，刘建民，宁光，等.绝经后妇女护骨素基因G1181C多态性与骨密度变化相关性［J］.中华内分泌代谢杂志，2005，21（1）：55－58.

［5］ Arko B，Prezelj J，Kocijancic A，et al.Association of the osteoprotegerin gene polymorphisms with bone mineral density in postmenopausal women［J］.Maturitas，2005，51（3）：270－279.

［6］ Ohmori H，Makita Y，Funamizu M，et al.Linkage and association analyses of the osteoprotegerin gene locus with human osteoporosis［J］.J Hum Genet，2002，47（8）：400－406.

［7］ Ueland T，Bollerslev J，Wilson SG，et al.No associations between OPG gene polymorphisms or serum levels and measures of osteoporosis in elderly Australian women［J］.Bone，2007，40（1）：175－181.

［8］ Vidal C，Brincat M，Xuereb Anastasi A.TNFRSF11B gene variants and bone mineral density in postmenopausal women in Malta［J］.Maturitas，2006，53（4）：386－395.