姜黄素衍生物的合成及其抗肿瘤活性

魏 冬， 姜 波， 薛 璇， 汪佳凤， 周双生

（现代中药安徽省工程技术中心，安徽中医学院药学院，安徽 合肥 230031）

姜黄素（Curcumin）是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等块茎中提取出来的一种天然产物，为二酮类化合物。姜黄具有破血行气、通经止痛等功效，一直作为药食两用的药材；此外，还用于治疗胸肋刺痛、闭经风湿肩臂疼痛及咽喉肿痛等。

多年研究表明，姜黄素具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗凝、抗人类免疫缺陷病毒、抗菌、抗肿瘤、抗突变等［1］。近期研究还显示，姜黄素的抑瘤作用机制主要与诱导肿瘤细胞凋亡有关，它是通过调控抑癌基因、癌基因及其蛋白的表达、诱导细胞周期停滞［2］及调控细胞凋亡信号等途径实现，除此之外，姜黄素还可能通过抗氧化、免疫调节、影响激素水平等机制达到抗肿瘤的目的［3］，因其低毒、低分子量、抗肿瘤作用广泛，曾被认为是理想的抗癌化学治疗药物之一。然而姜黄素在体内的溶解性小、体内吸收少、代谢过快，生物利用度低，极大地限制了它的应用。刘剑敏等人［4］将姜黄素结构修饰，使酚羟基改造成了N—马来酰—氨基酸一姜黄素单酯及乙酰姜黄素等衍生物，改善了脂溶性并增强了姜黄素在体内的活性。Ohtsu H等［5］将姜黄素的酚羟基甲基化得到的衍生物具有强烈的抗雄激素活性，能够用于前列腺癌的临床治疗，其效果要优于临床上使用的羟基氟他胺，而姜黄素本身没有这种活性。为了更好的探索姜黄素类化合物的抗肿瘤活性，本文制备了两种新型姜黄素衍生物。并评价了它们与生物大分子对接能力及其抗肿瘤活性。目标化合物合成路线如Scheme 1：

Scheme 1：目标化合物的合成路线

1 实验部分

1.1 试剂与主要仪器

姜黄素，溴乙烷，苄基氯，购至国药基团化学试剂有限公司，均为分析纯。人乳腺癌细胞MCF－7（中科院上海细胞生物学研究所细胞库）。培养基：RPMI－1640培养粉（美国GIBCO公司），用三蒸水配制，添加10%小牛血清，无菌过滤，4℃备用。MTT（3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐，又称为噻唑蓝，美国sigma公司）；TriPure试剂盒。

WRS－1B数字熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；Nicolet Avatar 370DTGS 型红外光谱仪（美国）；Bruker 400MHz超导核磁共振仪（德国）；TSQ Quantum Access MAX三重四极杆液质联用仪（美国）。

1.2 姜黄素衍生物的合成

（1）二乙基姜黄素的合成（B）

将1g姜黄素（A）溶解在20ml N，N－二甲基甲酰胺中，随后投入1.2g碳酸钠固体，80℃下回流反应15min后加入5ml溴乙烷，随后继续反应3h（TLC跟踪），反应完成后加入100ml水溶解钠盐，用乙酸乙酯萃取混合液三次，合并有机层，用1mol／L氢氧化钠溶液洗涤有机层数次，再水洗数次后加入无水硫酸镁，蒸干有机层可得固体。此固体用硅胶柱分离，V（石油醚）：V（乙酸乙酯）＝8：1为洗脱剂，收集产物，得橙黄色固体0.43g，产率为37.3%，m.p：141－142℃；IR （KBr）υ ：2927（CH3），1627（C＝O），1513（C＝C），1588，1468，1419（Ar），1261 （＝CH），804，711（CH）；1H－NMR（CDCl3，400MHz）δ：1.47 （t，6H，J＝8Hz，CH3），3.93（s，6H，－OCH3），4.12（q，4H，J＝8Hz，CH2），5.81（s，2H，CH2），6.51 （d，2H，J＝16Hz，＝CH），7.08－7.13（m，6H，Ar－H），7.62（d，2H，J＝16Hz，＝CH－Ar）；MS（ESI）m／z：424。

（2）三苄基姜黄素的合成（C）

化合物C的合成方法与B类似，用苄基氯替代了溴乙烷。得到的固体用硅胶柱分离，V（石油醚）：V（乙酸乙酯）＝10：1为洗脱剂，收集产物。得淡黄色固体0.47g，产率为33.2%，m.p：157－159℃；IR（KBr）：2931（CH3），1634（CO），1521（C＝C），1596，1501，1435（Ar），1269（＝CH），953，856，812（CH）；1H－NMR（CDCl3，400MHz）δ：3.96（s，6H，CH3），3.85（s，4H，－OCH2），5.16 （s，1H，CH2），6.53 （d，2H，J＝16Hz，＝CH），6.79－7.40（m，15H，Ar＇－H），7.35（m，6H，Ar－H），7.67 （d，2H，J＝16Hz，＝CHAr）；MS（ESI）m／z：628。

1.3 分子对接

分子对接［5，6］是药物发现研究中的关键步骤，也是最直观了解生物大分子与药物小分子相互作用的手段。人类乙二醛酶是癌症细胞主要排毒通道中重要的功能性蛋白，是公认的有效抑制癌症的作用靶点之一。我们运用 MOE（Molecular Operating Environment）软件［7］模拟了目标化合物分子与人类乙二醛酶中1Q1N蛋白［8］的对接情况，并计算出它们各自的结合作用能力。

1.4 抗肿瘤活性

将MCF－7细胞接种于75ml细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，与37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，3天传代1次。取对数生长期细胞消化、以4.0×104／孔的密度接种于96孔板，培养24h后，分别加入含药物的培养液100μl继续培养24h。按药物浓度2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0μmol／L分为6组，每组设6个复孔。对照组以培养液取代，也设6个复孔。在时间结束前4h，每孔加MTT 20μl，培养技术后，吸弃上清液，每孔加入DMSO 150μl，振动10min，用酶标仪570nm处测定每孔D值。计算药物对细胞增殖的抑制率如下：

2 结果与讨论

2.1 姜黄素衍生物的结构确认

2.1.1 乙基姜黄素（B）的结构

由核磁氢谱中数据可知，7.62ppm处的双重峰位于连接苯环双键H的化学位移，7.08－7.13ppm区间出现的多重峰属于苯环的H的化学位移，6.51 ppm处的双峰为非连苯环的双键H的化学位移，4.70ppm附近的单峰峰属于连在两个羰基间的亚甲基H的化学位移，在4.12ppm处出现的四重峰属于氧乙基中亚甲基H的化学位移，3.93ppm出现的单峰归属于甲氧基的H的化学位移。同时根据红外光谱的数据1627cm－1处有一强共轭羰基吸收峰，1513cm－1是碳碳双键吸收峰，1588，1468，1419cm－1处则为苯环骨架吸收峰。质谱中明显存在目标化合物m／z的分子离子峰，表明该物质分子在常温下较稳定。综合上述数据可知，该化合物即为实验要合成的目标化合物B。

2.1.2 苄基姜黄素（C）的结构

根据核磁氢谱中数据可知，7.67ppm处的双重峰位于连接苯环双键 H的化学位移，7.40～7.35 ppm区间出现的多重峰属于姜黄素苯环的H的化学位移，7.19－6.79ppm区间出现的多重峰则属于苄基苯环的H的化学位移，6.53ppm处的双峰为非连苯环的双键H的化学位移，5.16ppm处的单峰峰属于连在两个羰基间的亚甲基H的化学位移，在4.22ppm处出现的四重峰属于乙酸乙基中末端亚甲基H的化学位移，3.87ppm处的单峰归属于连接双酮氧上苄基的乙基中H的化学位移，由于此处的氢峰的位置化学位移较低，如果苄基取代在双酮之间碳上的活泼氢，此时苄基上的乙基的化学位移应该较高，故推测苄基是接在双酮氧上，而不是在其亚甲基位置，此外3.36ppm处的单峰归属于甲氧基中的甲基H的化学位移。同时根据红外光谱的数据1634cm－1处有一强共轭羰基吸收峰，1521cm－1是 碳 碳 双 键 吸 收 峰，1596，1501，1435 cm－1处则为苯环骨架吸收峰。质谱中明显存在目标化合物m／z的分子离子峰，表明该物质分子在常温下较稳定。综合上述数据可知，该化合物即为实验要合成的目标化合物C。

2.2 生物活性实验

以姜黄素为阳性对照，采用经典的MTT法对化合物B和C进行了体外抗肿瘤活性测试，细胞株选用人乳腺癌细胞MCF－7，实验结果见表1和图1。

图1 不同浓度的姜黄素及其衍生物对MCF－7细胞的抑制率（24h）

表1 不同化合物对MCF－7的IC50（24h）

从表1中数据可以看出，化合物B和C具有良好的抗肿瘤活性，其中化合物B，即二乙基姜黄素，对MCF－7的IC50值为19.23μM，优于姜黄素（A）本身（IC50为38.65μM），这可能是由于姜黄素上氢被乙基取代带后，增加了其脂溶性，使其生物利用度增加，从而使其活性增强，这与文献报道一致［4，5］；而化合物C，即三苄基姜黄素，其活性不及姜黄素，这可能是由于姜黄素分子中引入多苄基后，分子空间位阻增大，它与受体结合能力减弱，使其活性降低（IC50为57.31μM）。

一般情况下，受体与药物分子之间作用力越强，其本身能量降的越低，形成的分子越稳定，其生物活性越强。为了进一步佐证目标化合物的生物活性，我们应用了MOE评价了药物与靶点分子对接，即以目标物分子与乙二醛酶1Q1N蛋白分子发生对接结合作用，实验情况见图2～图4。

图2 姜黄素（A）与1Q1N蛋白空间结合图及能量表（Kcal／mol）

图3 二乙基姜黄素（B）与1Q1N蛋白空间结合图及能量表（Kcal／mol）

图4 苄基姜黄素（C）与1Q1N蛋白空间结合图及能量表（Kcal／mol）

其实验结果与数据显示，化合物与靶点蛋白结合能降低值大小顺序为：B（二乙基姜黄素，－41.94 KJ／mol）、A（姜黄素，－38.51KJ／mol）、C（三苄基姜黄素，－32.78KJ／mol），明上述化合物与受体作用效果：B物最强，C物最弱，这与上述 MTT法体外测试抗肿瘤活性结果相一致。

［1］赵心宇，孟秀香，贾莉等.姜黄素抗肿瘤机制［J］.实用药物与临床，2006，9（1）：51－52.

［2］Park MJ，Kim EH，Park IC，et al.Curcumin inhibit，cell cycle progression of immortalized human umbilreal vein endothelial（ECV304）cells by up－regulation cyclin－dependent kinase inhibitor，p21WAF1／CIP1，p27KIP1and p53［J］.Int J.Oncol，2002，21（2）：379－383.

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［4］刘剑敏，姜风超.抗肿瘤前药一姜黄素衍生物的设计合成及初步活性测试［J］.中国药师，2005，8（7）：543－545.

［5］Ohtsu H，Xiao ZhiYan，Ishida J，et a1.Antitumor agents 217 curcumin analogues as novel androgen receptor antagonists with potential as antiprostate cancer agents［J］.J Med Chem，2002，45（23）：5037－5042.

［6］周家驹，王亭.药物设计中的分子模型化方法［M］.北京：科学出版社，2001：56－64.

［7］杨华峥.农药分子设计［M］.北京：科学出版社，2003：145－167.

［8］乔园园，郭盛.分子模拟软件MOE及其在药物中的应用示例［J］.计算机与应用化学，2005，22（2）：157－160.

［9］Minggui Yuan，Minxian Luo，Yao Song，et al.Identification of curcunmin derivatives as human glyxalase I inhibitors：A combination of biological evaluation molecular docking，3D－QASR and molecular dynamics simulation studies［J］，Bioorganci＆Medicinal Chemistry，2011，19：1189－1196.