抗大肠杆菌荧光抗体的制备及其特性

孙 庆 元, 王 建 军, 刘 建 文, 郇 晓 娜, 朱 友 双

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

大肠杆菌在自然界广泛分布,主要寄居于人和动物肠道中。近年来,家禽大肠杆菌病在国内大多数养殖场中广泛流行,发病率和死亡率居高不下,很多地方已呈爆发性流行的趋势,严重威胁着养禽业,造成了巨大的经济损失。

目前,致病菌的检测方法主要是实时荧光定量PCR技术[1-3]、流式液相芯片检测方法[4]和酶联免疫法[5]等。到目前为止,国内有关荧光标记抗体检测大肠杆菌方法的报道还很少。由于传统的细菌鉴定工作量大、费时长并只能用于粗略检测, 因而人们都在寻求对重要病原菌快速、简单、准确的检测方法。本研究以大肠杆菌为案例,采用荧光抗体技术来检测大肠杆菌的存在, 以期达到快速、准确诊断疾病的目的。异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate, FITC) 能与抗体交联,抗体仍能保持与相应抗原结合的能力。荧光抗体在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光,通过荧光显微镜可对相应抗原进行定性、定位和定量的检测[6-8]。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

新西兰大白兔,小白鼠,大肠杆菌；异硫氰酸荧光素(FITC)；弗氏不完全佐剂 (incomplete Freund′s adjuvant, IFA)；双缩脲试剂。

UV755B紫外/可见光分光光度计,轮转式切片机,倒置荧光显微镜。

1.2 方 法

1.2.1 抗大肠杆菌免疫血清的制备

免疫源的制备:实验前一天,在37 ℃、200 r/min 条件下,于20 mL营养肉汤中过夜培养大肠杆菌。10 000g、20 min、4 ℃离心,将上清液与沉淀分离,所得沉淀即是大肠杆菌菌体。用1 mL生理盐水溶解沉淀,制备得到大肠杆菌菌悬液备用。

免疫血清制备:大肠杆菌菌悬液与弗氏不完全佐剂乳化,采用皮下注射,首兔剂量1.2 mL/kg,加等量弗氏不完全佐剂,皮下分点注射；二兔、三兔、四兔剂量均为0.2 mL/kg, 不加佐剂, 耳缘静脉注射。15 d后,颈动脉放血法采血分离血清后置于冰箱,4 ℃保存备用。

1.2.2 抗大肠杆菌免疫血清IgG的提取

采用正辛酸-饱和硫酸铵法提取兔抗大肠杆菌免疫血清IgG[9]。

两步沉淀法:先加正辛酸去杂蛋白,后加硫酸铵使抗体沉淀。并用280和260 nm的吸收差法测定蛋白浓度。

1.2.3 荧光标记抗体的制备和检测

抗体与异硫氰酸荧光素 (FITC)交联:将IgG移入烧杯,按每毫克抗体加入1 mL碳酸缓冲液(pH 6.7)的比例,装入透析袋中。另称取0.3 mg FITC溶于30 mL碳酸缓冲液中。透析袋置于其中,避光的条件下,边透析边搅拌4～6 h。透析完成后,拿出透析袋,于流动的自来水中透析10 min。移入10 mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液中,在4 ℃下透析,直到透析液在紫外光灯下不呈现荧光为止。最后透析完成后,加入氯化钠(最终质量分数为0.02%)于4 ℃冰箱中保存。

将与FITC交联的抗体稀释30倍(取0.1 mL抗体,加0.9 mL蒸馏水和2 mL双缩脲试剂),空白对照为1 mL蒸馏水加2 mL双缩脲试剂。静置30 min,在波长495 nm处测定吸光值,计算得出的F/P反映抗体与FITC的交联质量,F/P越高表示抗体结合的荧光素越多。

F/P=2.87A495/(A280-0.35A495)

1.2.4 大肠杆菌表面蛋白抗体特异性检测

分别制备大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌菌悬液,制成涂片,用制备的大肠杆菌荧光标记抗体染色,镜检。

1.2.5 小白鼠内大肠杆菌表面蛋白抗原的跟踪

制备大肠杆菌菌悬液,采用肌肉注射打入小白鼠体内,间隔1 h打入抗大肠杆菌荧光抗体。再过2 h后解剖小白鼠,取其肝脏、心脏、肾脏、大肠浸泡于生理盐水中,对肝脏、心脏、肾脏、大肠进行切片,利用荧光倒置显微镜,分别在可见光和蓝光下观测。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌细胞表面蛋白抗体与FITC交联

将成功提取出来的IgG利用280和260 nm的吸收差法测定蛋白质浓度为1.7 mg/mL,用所得大肠杆菌表面蛋白抗体与荧光素FITC交联通过计算得到F/P为2.7(见表1)。当F/P过低时,荧光很弱,降低敏感性;但过高时,非特异性染色增强,不利于实验中的观察[10]。由表1可知,本实验小白鼠肝特异性膜蛋白抗体与荧光素FITC交联可用于对抗原的检测。

表1 大肠杆菌抗体与FITC的交联

大肠杆菌细胞表面蛋白抗体与FITC交联反应后,并经透析处理,除去非交联的FITC,在蓝光(波长470～475 nm)下观察到较强的荧光(如图1所示),说明大肠杆菌细胞表面蛋白抗体已与FITC交联。

图1 蓝光下观察到的抗大肠杆菌荧光抗体(荧光倒置显微镜100×)

Fig.1 The fluorescence of FITC-antibody of anti-E.coliobserved under the blue light (Inverted fluorescence microscope 100×)

2.2 大肠杆菌细胞表面蛋白抗原特异性

将抗大肠杆菌荧光抗体分别与大肠杆菌悬浮液、金黄色葡萄球菌悬浮液以及乳酸杆菌悬浮液黏合,大肠杆菌与抗大肠杆菌荧光抗体黏合后,置于荧光倒置显微镜分别在蓝光和可见光下进行观察。如图2所示,在可见光下看不清大肠杆菌；在蓝光下,观察到很多显示荧光的大肠杆菌,但未观察到显示荧光的金黄色葡萄球菌以及乳酸杆菌。这是因为只有大肠杆菌和抗大肠杆菌荧光抗体结合绑定后,附在大肠杆菌表面的荧光抗体才能在蓝光激发下可释放荧光。

图2 不同光源下的大肠杆菌与抗大肠杆菌荧光抗体的黏合(荧光倒置显微镜100×)

Fig.2 The fluorescence in the adhesion with the FITC-antibody of anti-E.coliand theE.coliunder different lights(inverted fluorescence microscope 100×)

如图2所示,本研究所制备的荧光抗体对金黄色葡萄球菌和乳酸杆菌均无特异性, 只对大肠杆菌表面蛋白抗原具有特异性,并且抗大肠杆菌抗体与FITC交联后,仍然可以黏合大肠杆菌,未发现影响其抗体的特异性。

2.3 动物体内大肠杆菌表面蛋白抗原的跟踪

分别将大肠杆菌和抗大肠杆菌荧光抗体肌肉注射入小白鼠体内,利用荧光倒置显微镜,对小白鼠肝脏、心脏、肾脏、大肠进行切片,并分别在蓝光下检测这些器官是否存在大肠杆菌。

2.3.1 肝脏、心脏和肾脏切片分析

如图3所示,小白鼠肝脏、心脏、肾脏切片内只观察到组织细胞,并没观察到荧光。这说明在小白鼠的肝脏、心脏、肾脏中都没有抗大肠杆菌荧光抗体与大肠杆菌发生作用,说明大肠杆菌未进入小白鼠的这些器官中,或者进入的大肠杆菌被这些器官的免疫细胞或组织杀灭,并且这些器官本身没有大肠杆菌的存在。

2.3.2 大肠切片分析

对4组小白鼠进行处理,以验证大肠杆菌在小白鼠体内存在的位置。处理方法和结果见表2。

图3 蓝光下不同组织切片形态观察(荧光倒置显微镜100×)

Fig.3 The fluorescence in the FITC-antibody of anti-E.colifrom the slices of different organs under the blue light (inverted fluorescence microscope 100×)

表2 不同小白鼠的处理方法和荧光检测强度

Tab.2 The fluorescence intensity in the large intestine from different treatment methods with the mouse

小白鼠A小白鼠B小白鼠C小白鼠D注射大肠杆菌数/个27×10814×108无无注射荧光抗体量/mg1.00.11.00.1荧光强度强弱中低注:荧光强度强弱依次为强、中、弱、低。

利用荧光倒置显微镜,在蓝光下分别对小白鼠的大肠切片进行观察,如图4所示。从图4(a)中可以看出,在蓝光下可以观察到荧光的存在,抗大肠杆菌荧光抗体与大肠杆菌结合并绑定在一起,在蓝光的激发下显示出荧光,这说明注入的大肠杆菌进入到小白鼠A的肠道中被抗大肠杆菌荧光抗体识别并绑定,或者小白鼠A的肠道中本身就存在大肠杆菌,被注入的抗大肠杆菌荧光抗体识别。

抗大肠杆菌荧光抗体具有对大肠杆菌的特异性识别功能,能够在小白鼠体内追踪大肠杆菌的存在,并与之发生特异性反应。小白鼠C的大肠切片中也发现中等强度的荧光,说明在没有注射大肠杆菌之前,小白鼠的肠道中就有大肠杆菌的存在。小白鼠A的大肠切片中发现了高强度的荧光,说明注射的大肠杆菌通过血液进入肠道,肠道组织允许大肠杆菌存在于肠道中。小白鼠C和D体内并没有人为注入的大肠杆菌,但在荧光倒置显微镜下依然观察到了荧光的存在,由于小白鼠A注入了大肠杆菌,而小白鼠C没有注入,从图4可以看出小白鼠A的大肠切片中的荧光强度强于小白鼠C,而小白鼠B和D由于注入荧光抗体的量偏小,所以荧光强度都不强(表2),说明荧光强度取决于注射的抗大肠杆菌荧光抗体的浓度和大肠杆菌的多少。

从图4(a)可以看到,小白鼠大肠内的大肠杆菌聚集在一起,可能是解剖时由于小白鼠的惊慌导致了不正常的排泄物；或者在大肠切片时,厚度、长度、切的部位不完全一致等因素造成的影响。

图4 小白鼠A和C的大肠组织切片荧光观测(荧光倒置显微镜100×)

Fig.4 The fluorescence from the slices of the large intestine of mouse A and mouse C (inverted fluorescence microscope 100×)

3 结 论

荧光抗体标记技术比ELISA[11]更直观, 在荧光显微镜下观察到的抗大肠杆菌荧光抗体的荧光可直接判断抗原是否存在以及在组织切片中抗原所在的位置。荧光抗体技术在临床检验上可用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等[12-14]。

本研究对制备和纯化的抗大肠杆菌IgG 进行了FITC标记,获得了大肠杆菌的荧光标记抗体,抗大肠杆菌荧光抗体对抗原具有特异性,FITC与IgG交联后未发现对IgG的活性产生很大影响。抗大肠杆菌荧光抗体对大肠杆菌能够特异性识别,在小白鼠体内能够对大肠杆菌进行追踪,通过对小白鼠各个组织器官的切片观察,验证了大肠杆菌在小白鼠体内组织器官中的存在。该检测方法比细菌分离鉴定法在检测大肠杆菌感染上更灵敏、简单、快速,其特异性与检出率方面优于微量平板凝集法,可根据观测的荧光存在强度定性和定量地判断抗原,为大肠杆菌病的流行病学调查、临床快速诊断提供了一定的方法。

[1] 白雪梅,李太元,杨兴,等. 应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌[J]. 水产科学, 2010, 29( 10):613-615.

[2] 周东顺,朱瑞良. 直接荧光抗体法检测禽波氏杆菌[J]. 畜牧与兽医, 2004, 36(9):34-35.

[3] 邵秀玲,甘琴华,赵文军,等. 利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌[J]. 植物检疫, 2009, 23(5):25-27.

[4] 邱杨,肖性龙,吴晖,等. 五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立[J]. 现代食品科技, 2010, 26(8): 889-903.

[5] 杨春晓,王小娥,朱瑞良,等. 禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2008, 39(12):1715-1720.

[6] 朱明华,朱瑞良,王慧,等. 鸡奇异变形杆菌外膜蛋白的抗血清制备及其荧光标记抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2010, 32(8):603-606.

[7] 张胜华,程昕,钟根深,等. 活体成像分析异硫氰酸荧光素标记Rituximab在荷淋巴瘤裸鼠体内的生物分布[J]. 中华医学杂志, 2010, 90(33):2367-2370.

[8] BRITTON R A, POWELL B S, DASGUPTA S, et al. Cell cycle arrest in ERA GTPase mutants a potential growth rate regulated cell cycle checkpoint inEscherichiacoli[J]. Molecular Microbiology, 1998, 27(4):739-750.

[9] 周顺武. 动物生物化学实验指导[M]. 2版. 北京: 中国农业出版社, 2001:112-116.

[10] 蔡文琴,王伯沄. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都:四川科学技术出版社, 1994:54-63.

[11] 朱水芳. 转基因植物产品检测技术[M]. 广州:广东科技出版社, 2003:239-241.

[12] 孙玮红,李树清,徐红. 大白鼠血清IgG 提纯及其抗血清的制备[J]. 动物检疫, 1994, 11(1):11-12.

[13] 黄春保,慈云祥,常文保. 异硫氰酸荧光素-人血清白蛋白标记物化学发光反应的研究[J]. 分析科学学报, 2001, 17(3):186-189.

[14] 张葵,汪涛,李琦,等. 小鼠抗兔IgG单克隆抗体的制备与应用[J]. 标记免疫分析与临床, 2008, 15(1):47-52.