饲用纤维素酶检测方法的研究

王冠徐丽丁皓程瑛

(武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉 430074)

纤维素是植物细胞的主要成分，属于一种葡聚糖天然高分子化合物，由葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成[1]，它难以被单胃动物消化，并且对饲料中各种养分的利用具有明显的干扰和抑制作用[2]。

研究表明,向饲料中添加纤维素酶，不仅能有效地消除纤维素的抗营养作用，而且能促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，提高饲料代谢能值和动物的生产性能，增进畜禽健康，减少畜禽排泄物对环境的污染及拓宽饲料原料应用的范围[3]。因此，纤维素酶在饲料工业中具有广阔的应用前景[4]。

纤维素酶（cellulase）是指能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键使纤维素变成葡萄糖的一组酶的总称。它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，包括：内切葡聚糖酶（EG或CX）、外切葡聚糖酶（CBH、EC 或 C1）、β-葡萄糖苷酶（CB纤维二糖酶）[5-7]，而且纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活性的测定方法很多，且复杂而不统一。

目前，饲用纤维素酶的国家检测标准有羧甲基纤维素钠(CMC)法(NY/T 912—2004)和滤纸法(GB/T 23881—2009)。本试验参照标准，分析了CMC法检测纤维素酶的适应性，并对两种方法的测定结果进行了比较，以期为制定统一的纤维素酶活性的测定方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

羧甲基纤维素钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、无水亚硫酸钠、葡萄糖、醋酸、醋酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠（上述试剂均为分析纯），Whatman 1号滤纸条（1.0 cm×6.0 cm）。

纤维素酶样品均采购于市场。

紫外-可见分光光度计（Unico UV2800）、水浴摇床、漩涡混合器、电子天平（万分之一）、恒温水浴锅、移液器、秒表等。

1.2 试验方法

纤维素酶的CMC酶活性参照标准NY/T912—2004；纤维素酶的滤纸酶活参照标准GB/T 23881—2009。

取纤维素酶样品，根据标示酶活性，在可取值范围内采用不同稀释倍数对酶液进行稀释后，分别采用CMC法和滤纸法检测其活性，考察了CMC法的适应性，并对两种方法的结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

CMC法检测纤维素酶活性的标准曲线为y=1.114 7x+0.106 5（R2=0.999 5），滤纸法检测纤维素酶活性的标准曲线为y=1.113 8x+0.104 2（R2=0.999 6），二者基本一致。CMC法和滤纸法的标准曲线使用的缓冲体系不同，CMC法采用的是0.1 M乙酸盐缓冲液，而滤纸法采用的是0.05 M柠檬酸盐缓冲液，pH值均为5.5，尽管两种方法的缓冲体系不同，但对反应基本没有影响，得到的标准曲线一致。

2.2 CMC法检测纤维素酶活性的适应性

取不同公司的纤维素酶样品A、B、C，参照NY/T912—2004，采用不同的稀释倍数对酶液进行稀释，使其吸光值都在标准曲线的可取值范围内，测得的结果见表1。

由表1可见，随着稀释度的改变，测得的酶活性会随之改变，稀释度越大，测得的酶活性越高，反之就越低。根据CMC法的标准曲线，测得的样品吸光值在0.1～0.8的范围内都是有效的，但由表1的结果可知，不同的有效吸光值得到的纤维素酶CMC活性差异非常大，如：样品A稀释1 250倍时吸光值0.755，测得酶活性为1 097 U/g；稀释20 000倍时吸光值为0.162，测得酶活性为5316U/g，前者酶活性仅为后者的20.6%。当然，这2个吸光值差异较大，根据NY/T 912—2004，推荐稀释后酶液活性保持在0.04～0.08 U/ml，根据标准曲线进行换算后即为样品吸光值在0.15～0.4范围内较适宜，即使保证样品吸光值在推荐的取值范围内，测得的酶活仍然差异显著：如样品A稀释20 000倍时吸光值为0.162，测得酶活性为5 316 U/g，而样品A稀释10 000倍时吸光值为0.289，测得酶活性为3 969 U/g，两者差异极大。样品B和C也是如此。

理论上讲，在可取值范围内测得的酶活性应该差异很小。出现这种情况的原因可能是纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和还原基团的单糖在沸水浴条件下与DNS发生显色反应，用标准葡萄糖溶液作标准液，通过分光光度计在540 nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1 μmol的葡萄糖为一个酶活性单位。但纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，普遍认为以羧甲基纤维素等无定形纤维素为底物，以还原糖的生成量表征酶活性的CMC法表征的是内切葡聚糖酶的活力，俗称CMCase或CX酶活性。

根据酶促反应动力学通则，酶活性的测定是在底物过量存在的条件下，测定酶促反应的初速度来表示酶活力。CMC法检测纤维素酶的CX酶活性，根据NY/T 912—2004，底物浓度为 8.0 g/l，在仅检测内切葡聚糖酶活性的情况下底物应该是过量的[8]，符合酶促反应动力学。但实际上纤维素酶是多组分酶系，各组分间有协同作用，涉及多种反馈控制机理[5-6]，理论上采用CMC法检测内切葡聚糖酶活性，可同时，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶也在发挥作用，导致酶促反应的模式发生改变，成为多种酶协同作用高效分解底物CMC，这种情况下原先的底物浓度就无法保证酶促反应中底物过量的原则，测得的初速度也无法真实反映纤维素酶的活性，从而导致了CMC检测纤维素酶的试验中出现了稀释倍数越高测得酶活性越高的情况。实际检测时情况就更加复杂了，不同公司的纤维素酶，来源不同，生产工艺亦不同，导致了它们的纤维素酶组成不同，协同作用的效率也不同，难以用CMC法测得的初速度来表征其纤维素酶或内切葡聚糖酶的真实活性。

那么，提高底物CMC的浓度是否能改变这一状况？以样品A为例，分别试验了CMC底物浓度为16.0 g/l和24.0 g/l时不同稀释倍数下测得的酶活性(见表2)。

表2 不同底物浓度下CMC法检测纤维素酶活性

如表2所示，一方面，随着底物浓度的提高，同样稀释倍数下测得的纤维素酶活性也有所提高，说明确实存在着底物浓度不足的问题；另一方面，尽管底物浓度提高了，可不同稀释倍数间测得的酶活性依然存在一定的差异，不过，随着底物浓度的增加，这种差异也越来越小。考虑到不同公司的纤维素酶样品间存在差异，要将底物浓度提高到什么程度才能完全解决CMC法的适应性问题，还不好下定论。目前看来，要解决这个问题，首先是规定较高的底物浓度，其次是规定较窄的取值范围，这样可以极大地提升CMC法检测纤维素酶活力的适应性，在目前饲用纤维素酶普遍采用CMC检测的情况下，要规范市场秩序，促进饲用纤维素酶的良性发展。

2.3 CMC法和滤纸法检测纤维素酶活性的比较

取不同公司的纤维素酶样品，参照NY/T 912—2004和 GB/T 23881—2009（取值范围均为 0.25～0.35），测得的结果见表3。

表3 CMC法和滤纸法检测纤维素酶活性

如表3所示，不同公司的纤维素酶分别采用CMC法和滤纸法进行检测，发现同一样品的CMC酶活性和滤纸酶活性差异较大，而且不同样品间的CMC酶活性和滤纸酶活性的比例也不同。

滤纸是聚合度和结晶度都居中等的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法得到广泛应用，它反映了3类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活性(FPA)。而CMC法主要检测的是纤维素酶的内切葡聚糖酶活性，因此，两种检测方法的结果有所不同。此外，不同公司的纤维素酶的组成不同，造成了测得CMC酶活性与滤纸酶活性的比例也有所差异。

滤纸法测定总酶活性虽然是一种通用的、公认的、经典的方法，但也受到DNS试剂的新鲜程度、沸水浴的激烈程度、滤纸单位面积大小及滤纸切割方式等因素的影响，特别是滤纸法，测得的纤维素酶活性要远远低于CMC酶活性，因此，尽管2009年国标滤纸法检测纤维素酶活性早已颁布，但市场推广率却极其有限，目前普遍使用的仍是2004年农业部的CMC法标准，而CMC法又存在着上述适应性较差的问题，造成了质量检验的不便，导致市场的混乱。

3 讨论与展望

本文通过对CMC法(NY/T912—2004)与滤纸法(GB/T 23881—2009)检测纤维素酶活性的分析，发现CMC法的适应性较差，应提高底物浓度并减小样品吸光值的取值范围来进行改善；滤纸法测得的纤维素酶活性远低于CMC酶活性，且不同公司的CMC酶活性与滤纸酶活性的比例不同。这是由于纤维素酶是多组分酶系，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，各组分间有协同作用，反应过程复杂，涉及多种反馈控制机理所造成的。目前普遍接受的纤维素酶协同作用模型是：C1酶破坏纤维素的结晶结构，作用于不溶性纤维表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，使纤维素易于水化，经C1酶作用后的纤维素分子结晶结构已经被破坏，CX酶即吸附在纤维素分子上面，从键的内部任意位置切开β-1，4-糖苷键，将纤维素分子断裂为纤维二糖和纤维三糖等。最后这些被裂解产物纤维二糖、纤维三糖和其他低分子纤维糊精由β-葡聚糖苷酶分解为葡萄糖。

纤维素酶活性的测定方法除CMC法和滤纸法外还有很多其他的方法，这就要求我们在选择具体方法时，必须考虑测定的具体目的，根据需要选择合适的方法[9]。

饲用纤维素酶作为绿色环保的新型饲料添加剂，在饲料工业中具有广阔的应用前景。而利用纤维素酶将纤维素降解，对纤维素酶活性的测定方法的研究是个重点，找到简单、快速、准确又合适的测定方法，会为纤维素酶的研究打开一扇大门，积极推进纤维素酶在各个领域的广泛应用。

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