天然叶黄素添加剂对中华鳖的急性毒性实验研究

刘海燕 李 超 薛 敏 杨振才

（1.河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024；2.中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地，北京100081）

水产动物有着五彩斑斓的体色，正常的体色代表着水产动物的年龄、健康及品质。很多水产动物特征性的体色归功于体内类胡萝卜素的类别及含量，这些类胡萝卜素不能在动物体内从头合成，必须依赖于外源食物中丰富的类胡萝卜素的提供[1]。然而，在现代集约化养殖过程中，一些水产动物的正常体色往往容易丢失，带来很大的经济损失。因此，采取营养调控手段通过饲料成分的改变来改善体色已成为水产品品质调控的重要内容。研究表明，在配合饲料中添加适宜的类胡萝卜素成为解决这一问题的一种途径。叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、花卉等绿色植物中的天然类胡萝卜素，在万寿菊中的含量最高。一些研究表明，来自万寿菊的叶黄素可以改善禽类[2]以及黄色系体色水产动物，如：黄颡鱼、锦鲤、杂交鲶和金鱼[3-6]等鱼类皮肤的颜色。中华鳖（Pelodiscus sinensis）是我国重要的水产经济动物，其体色为黄色的品质受到市场的青睐。然而，人工集约化养殖过程中这种黄色体色的丢失却降低了商品的价值。迄今为止，叶黄素在中华鳖饲料中的应用还未见报道。急性毒性试验处在毒理学研究的早期阶段，是水产饲料评价的重要参考依据，在将天然叶黄素应用到中华鳖饲料中之前有必要首先进行天然叶黄素添加剂对中华鳖的急性毒性实验研究。因此，本文将以中华鳖为研究对象，以天然叶黄素添加剂为受试物，旨在探讨天然叶黄素添加剂对中华鳖的急性毒性，为天然叶黄素在中华鳖饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 天然叶黄素添加剂

实验所用天然叶黄素添加剂（源自万寿菊）由广州智特奇生物技术有限公司提供，为黄色粉末状物质，脂溶性，叶黄素纯度为4%。

1.2 中华鳖

实验所用中华鳖购自石家庄邓庄中华鳖养殖场，选取当年孵化的中华鳖稚鳖，转入与实验用水质、温度和光照相同的养殖缸中适应15 d，以使中华鳖适应实验环境，每天投喂2次。

1.3 实验步骤

根据叶黄素为脂溶性的理化性质，依据GB/T22487—2008[7]，本实验确定的急性致毒方式为口服急性致毒法，分为单次和连续口服叶黄素两个实验。

1.3.1 单次口服急性毒性实验

1.3.1.1 实验设计

由于叶黄素不易溶于水，而且其黏合性及对中华鳖的诱食性均较差，很难单独给予受试动物，因此本实验将叶黄素添加剂与中华鳖稚鳖配合饲料混匀后制成小药丸，投喂给中华鳖。根据预实验结果，不能得到叶黄素添加剂对中华鳖的死亡剂量。因此，正式实验除了设一个对照组外，另设一个饲料中能最大搀入的添加剂量组，即叶黄素添加剂与对照饲料等量混合，加入一定量的水，制成小药丸，置于冰箱中备用。对照组饲料的原料组成及主要营养成分见表1中的D1组。本实验分为对照组和处理组两个实验组，每个处理组30个重复。

1.3.1.2 实验条件

实验在室内静水系统的玻璃缸中进行，每个玻璃缸（30 cm×60 cm×40 cm）饲养两只中华鳖，为避免鳖的相互残杀行为，在缸中用网隔将两只鳖隔开。缸内设有恒温器和充氧设备，光照采用自然光照加人工光照。使水温保持在(30±0.5)℃；光周期为14 L∶10 D；每6 h充氧一次，每次30 min，使溶氧保持在5 mg/l以上；每日换水量为1/3，注入已调好pH值且水温适宜的水，使pH值保持在8.0±0.5。

表1 实验饲料配方及营养成分（风干基础）

在正式实验之前,将中华鳖稚鳖称重，选取体重8.0 g左右的稚鳖60只，转入与实验用水质、温度和光照条件相同的30个玻璃缸中养殖15 d，每天定时投喂对照饲料2次（9：00、18：00）。正式实验开始时将30个玻璃缸随机分为两组（一组为对照组；另一组为实验组），每组30只中华鳖。中华鳖空腹24 h。受试物的给予方式为自主摄食，受试物制成的小药丸准确称重后投喂给中华鳖，投喂半小时后收集残饵，并进行溶失率的测定，以校正残饵量，准确计量中华鳖的摄食量。在随后的14 d观察期中，中华鳖的饲养管理与驯养期间的相同，详细观察并记录中华鳖的反应情况：行为、摄食、体色等方面的变化，发现死鳖及时捞出并详细记录。

1.3.2 连续口服急性毒性实验

1.3.2.1 实验饲料及实验设计

根据单次口服实验结果，由于不能求出天然叶黄素添加剂的经口急性毒性半致死剂量LD50，在进行连续口服急性毒性评价时，剂量的设计原则依据GB/T-22488—2008[8]和欧洲食品安全委员会 (EFSA)[9]靶动物有效性和耐受性试验规程，在不影响饲料营养水平的基础上设计最高剂量组为可能摄入剂量组的10倍以上。因此本实验设计了5个叶黄素添加剂剂量水平，分别为0（D1）、0.15%（D2）、0.3%（D3）、0.6%（D4）、8%（D5）。5组饲料的原料组成及主要营养成分详见表1。根据GB/T23187—2008[10]中的高效液相色谱法实际检测叶黄素在这5组实验饲料中的含量分别为1.16(D1)、70.3(D2)、132.0(D3)、239.0(D4)和3 410 mg/kg(D5)。因此本实验为单因素5个处理水平的设计，每个处理24个重复。粉料先用颗粒机制成直径为2 mm的软颗粒，用保鲜盒冷冻保存于-20℃冰箱中备用。

1.3.2.2 实验鳖及实验条件

正式实验开始时，选取120只体质健康、体重相近的中华鳖稚鳖，禁食24 h后称重，随机分配到60个玻璃缸中。每天定时（9:00、18:00）、定量投喂实验饲料，记录每只中华鳖每天的投喂量，同时测定各实验颗粒料的含水量。残饵在投喂30 min后用吸管吸出，在鼓风干燥箱中于65℃下烘干至恒重，称重记录。在相同的条件下用同样的方法测定各组饲料的溶失率，对残饵量进行校正。实验条件同1.3.1。实验期为21 d。

1.4 指标计算

摄食率(FI，%)=100×R1/[(Wt+W0)/2]；

饲料系数(FCR)=R1/(Wt-W0)；

特定生长率(SGR，%/d)=100×[ln(Wt)-ln(W0)]/t；叶黄素日摄入量[mg/(kg bw·d)]=FI×C；

存活率(%)=100×存活鱼尾数/初始鱼尾数。式中：R1——摄食量；

W0——鳖初体重；

Wt——鳖末体重；

t——实验天数；

C——叶黄素在饲料中的含量。

1.5 数据处理与统计分析

所有实验数据均采用Statistica 6.0软件进行单因素方差分析（oneway ANOVA）,若数据差异显著则进行Duncan's法多重比较，差异显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 单次口服急性毒性实验

实验组中华鳖的叶黄素添加剂实际摄入量为18 831 mg/（kg bw），其中叶黄素的实际摄入剂量为753.24 mg/（kg bw）。实验开始后，实验期间无论是对照组，还是叶黄素添加剂实验组[18 831 mg/（kg bw）]中华鳖没有任何异常反应，其游泳能力、呼吸功能和体色等均未出现异常变化，且每日摄食情况良好，行为安逸，没有一只中华鳖出现死亡。

2.2 连续口服急性毒性实验（见表2）

表2 天然叶黄素添加剂对中华鳖生长性能及饲料利用的影响

由表2可知：实验期间，所有实验组及对照组的中华鳖成活率均为100%。中华鳖对天然叶黄素添加剂在5个处理组中的日摄入量分别为：0、14.58、29.32、58.23、801.19 mg/(kg bw·d)；对天然叶黄素的日摄入量分别为：0.01、0.68、1.29、2.32、34.15 mg/(kg bw·d)。

在21 d的连续摄食叶黄素添加剂后，中华鳖的摄食、生长及饲料利用均未受到显著影响，各组间的摄食率、饲料系数和特定生长率均未达到显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

叶黄素是类胡萝卜素的含氧衍生物，具有很强的抗氧化能力，能够有效清除体内的自由基，对于预防和延缓老年性黄斑退化引起的视力衰退与失眠症等起着重要作用[11]，在营养和药用方面有着很大的应用前景，是近年来功能食品领域的研究热点。目前，对叶黄素安全性的评价已成为叶黄素利用的焦点[12]，相关的急性毒性试验也有一些研究报道。胡宪等（2009）对大、小鼠进行了叶黄素的急性毒性试验，结果表明，大、小鼠急性经口LD50＞10 000 mg/kg，认为叶黄素属无毒物质[13]；李大婧等（2008）对由叶黄素和α-亚麻酸组成的软胶囊进行了安全性毒理学评价，结果显示，根据急性毒性(LD)剂量分级标准，此叶黄素胶囊也属无毒级[14];Ravikrishnan等(2011)研究发现，含67%叶黄素的LutemaxTM2020产品对大鼠的经口LD50＞2 000 mg/kg，90 d的最大未观察到有害作用剂量（NOAEL,no-observed-adverse-effect-level）大于400 mg/(kg bw·d)[12];Kumar等(2009)[15]和Harikumar等(2008)[16]分别在大鼠的研究中发现，叶黄素90 d的NOAEL为210 mg/(kg bw·d)和400 mg/(kg bw·d)，这些剂量均是实验中的最大剂量。从以上结果可以看出，这些纯度很高的食品保健级叶黄素经毒理学安全评价的结果是无毒物质。

但是，应用于饲料中的天然叶黄素添加剂不同于食品保健级的产品，叶黄素的纯度较低。由于在从万寿菊提取过程中的一些加工工艺要求，叶黄素添加剂中存在着一些载体并残留着一些化学物质，它们是否会对水产动物产生负面影响，这对于将叶黄素添加剂应用到水产动物饲料中是一个值得思考的问题。尽管相关实验已经证明，一定剂量叶黄素添加剂在饲料中的添加可以改善禽类和鱼类的体色，也并未产生不良作用[2-6]，但有关叶黄素添加剂的急性毒性实验还未见报道，其毒性等级尚未知。因此，在本研究中我们采用含4%叶黄素的天然叶黄素添加剂作为中华鳖的受试物来测试叶黄素添加剂可能具有的毒性。

在本文单次口服致毒实验中，当受试物(叶黄素添加剂)剂量为18 831 mg/(kg bw)时，中华鳖没有出现一只死亡现象。依据GB/T 22487—2008《水产饲料安全性评价急性毒性试验规程》对受试物的急性毒性分级方法，需根据LC50或LD50数值，判定受试物的毒性分级，若水产动物的口服受试物剂量LD50在5 001～15 000 mg/(kg bw)，则判定为实际无毒[7]。因此本试验中天然叶黄素添加剂对中华鳖经口LD50＞18 831 mg/(kg bw)，可以判定本实验中所用天然叶黄素添加剂为实际无毒物质，这与纯度很高的食品保健级叶黄素的结果相一致。在连续口服致毒实验中，尽管天然叶黄素添加剂的日摄入量高达801.19 mg/(kgbw·d)，21 d总摄入量为16 824.99 mg/kg时，中华鳖的摄食、生长及饲料转化率均未受到影响。因此，本实验中天然叶黄素添加剂对中华鳖的21 d NOAEL为大于801.19 mg/(kg bw·d)。

综上所述，本实验中所用天然叶黄素添加剂为无毒物质，可以添加到中华鳖的饲料中，不会对中华鳖产生毒性作用，但其对体色的改善效果，还需要进一步进行生长实验研究。

4 结论

①单次口服急性毒性实验结果表明，天然叶黄素添加剂对中华鳖经口LD ＞18 831 mg/(kg bw)，为实际无毒物质；

②21 d的连续口服试验结果表明天然叶黄素添加剂没有显著影响中华鳖的生长与饲料利用，其对中华鳖21 d的NOAEL为大于801.19 mg/(kgbw d)。

[1]Breithaupt D E.Modern application of xanthophylls in animal feeding-a review[J].Trends in Food Science&Technology,2007,18:501-506.

[2]周良娟，计成，李玉欣，等.几种天然叶黄素对肉鸡着色效果的研究[J].饲料工业，2003,24(4)：36-40.

[3]王鲁波，薛敏，王嘉，等.天然叶黄素对黄颡鱼生长性能和皮肤着色的影响[J].水产学报，2012,36(7):1102-1110.

[4]Yuangsoi B,Jintasataporn O,Areechon N,et al.The pigmenting effect of different carotenoids on fancy carp(Cyprinus carpio)[J].Aquaculture Nutrition,2011,17:e306-e316.

[5]史少奕，李小勤，冷向军，等.饲料中添加不同形式叶黄素对杂交鲶体色的影响[J].上海海洋大学学报，2010，19（2）：196-200.

[6]冷向军,石英,李小勤,等.饲料中添加叶黄素对金鱼体色的影响[J].浙江大学学报(农业与生命科学版)，2010，36（2）：168-174.

[7]薛敏，刘海燕，吴秀峰.GB/T22487—2008水产饲料安全性评价急性毒性试验规程[S].中国标准出版社,2009.

[8]薛敏，刘海燕，吴秀峰.GB/T22488—2008水产饲料安全性评价亚急性毒性试验规程[S].中国标准出版社,2009.

[9]EFSA(European Food Safety Authority).Technical Guidance:Tol⁃erance and efficacy studies in target animals,prepared by the Pan⁃el on Additive and Products or Substances used in Animal Feed[J].The EFSA Journal,2008,778:1-14.

[10]齐德生，于炎湖，陈红，等.GB/T23187—2008饲料中叶黄素的测定高效液相色谱法[S].中国标准出版社,2009.

[11]Mare-perlman J A,Fisher A I,Palta M,et al.Lutein and zeaxan⁃thin in the diet and serum and their relation to age-related mac⁃ulopathy in the third national health and nutrition examination survey[J].Opathalmology,2001,108:1992-1998.

[12]Ravikrishnan R,rusia S,ilamurugan G,et al.Safety assessment of lutein and zeaxanthin(Lutemax 2020):subchronic toxicity and mutagenicity studies[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49:2841-2848.

[13]胡宪，张莉华，许新德，等.叶黄素的毒理学安全性评价[J].食品工业科技，2009(5)：296-298.

[14]李大婧，宋江峰,雷芳,等.叶黄素软胶囊安全性毒理学评价[J].江苏农业学报，2008，24（4）：536-538.

[15]Kumar D P,Ravikumar C,Eswarappa R,et al.Sub-chronic(90 day)oral toxicity study in rats with lutein diacetate[J].Toxicolo⁃gy International,2009,16:55-62.

[16]Harikumar K B,Nimita C V,Preethi K C,et al.Toxicity profile of lutein and lutein ester isolated from marigold flowers(Tagetes erecta)[J].International Journal of Toxicology,2008,27:1-9.