TaqMan-MGB探针对HCV基因的检测及分型研究

林秀蓉，陈巧绘，林 海

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

慢性丙型肝炎10年内约有20%发展成肝硬化，而肝硬化患者每年约3%发展为肝细胞癌，因此丙型肝炎的快速分型与诊断是临床科学治疗的前提和基础［1］。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)属黄热病毒科，为单股正链RNA病毒，约9600个核苷酸，具有高度多态性和变异性，根据基因序列的同源性可分为不同的型和亚型［2］。Simmonds提出并根据HCV的5'-NCR区序列的差异，建立了HCV基因组序列的分型方法，将HCV分为6种基因型和30几种亚型［3］。在此分型方法的基础上，目前已报道的基因型有11个，亚型超过70种。我国主要以基因型1b为主，2a次之，3b在华南和西南地区流行，6a主要流行于港澳地区［4-5］。本研究针对国内检测较多的3种基因型分别设计TaqMan-MGB探针，将RNA逆转录为cDNA后，再利用探针进行分型，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2010年8月至12月收集来自福建某医院HCV-RNA阳性血清40例，其中男24例，女16例，年龄15～65岁，静脉采血4 ml于30 min内分离血清，－20℃冻存备用。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 主要仪器 ABI公司7500型 realtime-PCR仪，TGL-16G低温高速离心机，新加坡ESCO 4A-4A1生物安全柜。

1.2.2 主要试剂 HCV-RNA定量试剂盒购于南京冯阳生物技术公司，SuperScriptTMⅢ第一链合成试剂盒、RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司，探针及反应预混液购于上海基康公司。

1.2.3 探针及引物序列 对从美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载的HCV基因序进行比较和筛选，用Express 2.0设计基因探针(表1)。

1.3 方法 针对三型常见的丙型肝炎基因型，分别设计 TaqMan探针，在探针的 5'分别标记 FAM(FAM-1b，FAM-3b)、VIC(VIC-2a)，3'标记萃灭基因TAMARA和MGB基因。检测时每一个样品分两管进行，第一管加入FAM-1b和VIC-2a，第二管加入FAM-3 b和VIC-2a，将VIC设置为绿色，FAM-1 b设置为红色，FAM-3b设置为棕色，扩增结束后，根据读取的扩增曲线快速分型(图1)。

表1 试验所涉及的引物及MGB探针(探针1-3分别对应于1b、2a和3b基因)

图1 TaqMan-MGB探针检测HCV基因示意图

1.3.1 总RNA的提取 将200μl血液样本放入离心管，在离心管中加入800μl Trizol，室温混匀，放置5 min;加入200μl氯仿剧烈振荡15 s，室温放置2 min;4℃ 12000 r/min(离心半径8 cm，下同)离心15 min;仔细吸取上层水相到另一离心管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀后室温静置10 min;4℃12000 r/min离心10 min，弃上清;加入75%乙醇1 ml，充分洗涤沉淀;4℃ 7500 r/min离心5 min，弃上清，洁净工作台内吹风至沉淀干燥;将沉淀溶于10 μl DEPC处理的水中，立即进入cDNA第一链的合成。

1.3.2 cDNA第一链合成 反应体积20μl，其中10 mM dNTP 1 μl，10 pmol引物 Oligo(dT)1 μl，总 RNA 2 μl，RNA 酶抑制剂1 μl(40 U/μl)，SuperScriptTMⅢ0.5 μl(200 U/μl)，按以下条件进行反转录反应:95℃ 3 min，迅速置于冰浴中 2 min;42℃，90 min，70℃，15 min，37℃ 加入 RNAaseH(2 U/μl)1μl，孵育 20 min，4℃保存。

1.3.3 反应体系设计及检测 为了既节约又能检测目的序列，我们设计了双管法来检测HCV基因，探针Prob1、Prob2和引物F及R组成一组，用来检测1b和2a;探针Prob2和探针Prob3及引物F、R组成一组，用来检测2a和3b。反应在Stedp one realtime PCR仪中进行，反应设置为:50℃预变性2min，95℃始变性 10 min，95℃退火 10 s，60℃延伸 40 s，40个循环，每一次循环结束检测荧光，全部反应结束后检测荧光判读基因分型。

2 结果

利用荧光定量PCR TaqMan-MGB扩增建立的检测方案，对40个样本进行了检测。根据扩增曲线，可以方便快速地检测出大部分样本的基因型(图2)，共有39个样品被检出，检出率97.5%。其中，1b型29 例，占74.36%;2a型5 例，占12.82%;3b型6 例，占13.38%。

3 讨论

图2 扩增结果

HCV是一种经血液传播引起的慢性肝脏疾病的RNA病毒，其核酸是单股线性，正链RNA长约9.4 kbp。由于病毒缺乏RNA复制酶亦缺乏校正功能，复制时易引起基因突变，因此HCV病毒呈现高度异质性，不同地区、不同人群甚至不同个体分离到的病毒株基因组均不同。根据基因序列差异，目前HCV主要被划分为6个基因型，不同基因型的分布有地区差异。

我国大陆地区HCV基因型主要为1型，其次为2型，香港地区还有6型，其分布呈南北差异，南方以1型为主，北方2型逐渐增多［7］。郝飞等［6］报道，我国大陆地区1b型占80%，与本研究结果大致相当。但是近年由于人口流动增加，HCV的地域分布也有所变化，福建为沿海地区，对外交流多，人口流动快，人群中HCV基因型呈现动态变化，而不同的基因型对治疗的反应性不同。对丙型肝炎患者进行快速准确的分型是医治的前提和基础，准确的分型方法有助于提高丙型肝炎的医治水平［8］。

丙型肝炎的诊断，除症状体征及肝功能检查以外，主要是靠血清病毒学的实验室检测，而抗-HCV阳性是临床诊断的重要依据，根据丙型肝炎的基因分型，较具有说服力和实用价值。基因分型的方法很多，有测序法、酶切分型等［9-10］，TaqMan法是近年来应用较多的一种基因分型方法，其优点是检测的特异性较高，但是也有不足之处，比如专用试剂合成价格比较高、需要专业的公司合成等［11］。本研究使用的TaqMan-MGB探针基因分型方法，探针设计合理，灵敏度和特异性均较高，值得推广。

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