CD24在肝癌组织中的表达

房新辉 杨玉秀(河南省人民医院消化内科，河南 郑州 450003)

肝细胞癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，每年新发50万～100万例，我国约占半数，已成为肝癌发病最集中的地区之一。CD24是一种低分子量高度糖基化的黏附分子，具有多种功能性的糖基化模式。体外培养和动物模型已经证实，CD24对多种肿瘤的生长和转移具有调节作用。目前，有关CD24在HCC发生发展中的生物学作用和临床意义尚不明了。本研究拟探讨CD24在HCC中的作用及其与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 河南省人民医院70例肝脏疾病患者纳入本研究，男34例，女36例，年龄34～58〔平均(46±8)〕岁。其中肝血管瘤手术切除的周围正常肝组织20例，肝硬化手术切除肝组织20例，HCC手术切除组织30例，均经病理检查证实。肝硬化、HCC患者血清乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性。参照Edmendsen标准，HCC病理分级为Ⅰ级7例、Ⅱ级8例、Ⅲ级10例、Ⅳ级5例。三组病例年龄及性别有可比性。标本取出后置于液氮迅速冷冻，－80℃冰箱冻存待用。所取组织新鲜，并经过患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸基因芯片分析 按照Invitrogen公司的Trizol试剂盒操作程序，总RNA提取、cRNA合成、芯片杂交和检测、数据分析等方法见文献〔1〕。

1.2.2 反转录PCR (1)抽提总RNA:用Trizol试剂(QIAGEN公司)分别抽提正常肝组织、肝硬化和HCC组织总RNA。(2)扩增引物设计:内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物:5'GGGAAACTGTGGCGTGAT 3'，下游引物:5'AAAGGTGGAGGAGTGGGT 3';扩增片段长度309 bp。目的基因CD24上游引物:5'CTGCTGGCACTGCTCCTA 3，下游引物:5'AGAGTGAGACCACGAAGA 3';扩增片段长度178 bp。(3)CD24 cDNA合成及PCR扩增:按RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司提供)步骤进行反转录聚合酶链反应。先合成cDNA，再进行PCR。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。(4)扩增产物图像分析:对CD24扩增产物进行扫描和半定量分析，结果用Syngene Gene-Genius全自动凝胶成像系统(美国Syngene公司)检测图像灰度值。

1.2.3 免疫组织化学 (1)主要试剂:兔抗人CD24多克隆抗体(bs-0528R)购自北京博奥森生物技术有限公司，SP-9001羊抗兔免疫组织化学试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。标本经过苏木素-伊红(HE)染色明确诊断并确定病理分型。(2)免疫组织化学检测CD24:肝组织经梯度解冻，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚的石蜡切片，HE染色组织学观察。切片经高压热修复，采用免疫组织化学(ABC)法，DAB显色，HE复染，无水乙醇脱水，中性树胶封片。以0.01 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)(pH7.5)代替第一抗体作为阴性对照，以组织中显示棕黄色颗粒为CD24表达阳性。(3)CD24阳性判断标准:以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准，根据阳性细胞百分率分为阴性(－):阳性细胞不可见或阳性细胞不足5%;弱阳性(+):阳性细胞散在或为组织细胞的1/3以下;中度阳性(⧺):阳性细胞呈局灶分布，占全组织细胞1/3～2/3;强阳性(⧻):阳性细胞呈弥漫分布，占全组织细胞2/3以上。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，成组设计资料采用t检验、χ2检验、Fisher精确检验和Kruskal-Wallis非参数检验。

2 结果

2.1 寡核苷酸基因芯片分析结果 以人正常肝组织和肝硬化组织为对照，CD24在HCC中呈现明显上调表达(Ratio值=14.93，P＞0.5)。

2.2 RT-PCR分析结果 CD24 RT-PCR扩增产物电泳图谱显示，在相当于178 bp处有DNA片段区带。内参基因扩增产物显示在309 bp处有DNA片段区带。见图1。

HCC组织的CD24 mRNA阳性表达(27例)显著升高，正常肝组织(5例)与肝硬化组织(13例)比较差异显著(P＜0.01)，正常肝组织与HCC组织差异有统计学意义(P＜0.05)，肝硬化组织与HCC组织比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 免疫组织化学分析

2.3.1 CD24的阳性表达 CD24阳性表达物呈棕黄色颗粒，弥散分布于胞质，胞膜未见着色，不同病例的阳性胞质着色颗粒的大小、分布密度及着色深浅亦有不同，见图2。

正常肝组织与HCC组织CD24阳性表达差异有统计学意义〔4例(20%)vs 28例(93.3%)，P＜0.05〕，肝硬化组织与HCC组织比较差异无统计学意义〔14例(70%)vs 28例(93.3%)，P＞0.05〕，见表 1。

2.3.2 CD24表达强度与临床病理特征的关系 CD24表达强度与HCC组织分化程度、Edmendsen分级之间无明显相关性，见表2。

表1 正常肝组织、肝硬化组织和HCC组织中CD24蛋白的表达(n)

图1 CD24 mRNA阳性表达RT-PCR产物电泳图

图2 肝硬化及HCC组织CD24阳性细胞(×200)

表2 CD24表达强度与HCC组织分化及核分级的关系〔n(%)〕

3 讨论

HCC是癌基因或癌相关基因激活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致〔2〕。CD24是一种低分子量高度糖基化的黏附分子，由27个氨基酸组成，通过糖基磷脂酰肌醇黏附在细胞膜上。P-选择素是CD24的唯一配体〔3〕，通过低聚糖与CD24特异性结合。生理状况下，CD24能够介导单核细胞或中性粒细胞黏附于表达P-选择素的活化内皮细胞或血小板，抗P-选择素或抗CD24抗体可阻断这种黏附作用〔4〕。病理状态下，CD24介导癌细胞与活化血小板和内皮细胞的结合。因此，CD24/P-选择素的黏附途径被推测更有利于CD24阳性肿瘤细胞的浸润和转移行为。李海飞等〔5〕研究发现，CD24作为分离、纯化乳腺癌干细胞标志之一，被认为是乳腺癌预后不良因素。CD24蛋白质在肝内胆管癌中表达增强，CD24阳性患者生存期明显缩短，多变量分析表明CD24是肝内胆管癌的一个独立预后指标〔6〕。Huang等〔7〕在HCC中发现，CD24在66%单个癌灶HCC患者中表达上调，在68%的肝内多发瘤灶内上调表达。CD24与肿瘤的大小、分级及患者的预后无相关。CD24的表达可能是HCC早期的分子事件，联合甲胎蛋白(AFP)可以作为HCC早期预测指标。CD24可能通过上述一系列复杂机制促进HCC细胞的增殖，向周围组织侵袭转移，最终导致HCC的发生。

本研究显示，CD24在肝硬化组织中呈现表达增加现象，在HCC组织中的表达显著增加，推测CD24有可能作为HCC早期诊断的候选基因，也有望成为HCC的靶向分子治疗途径。

1 Su LJ，Ding GW，Yang ZL，et al.Expression patterns and action analysis of genes associated with hepatitis virus infection during rat liver regeneration〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(4):7626-34.

2 Heathcote EJ.Management of primary bilimary cirrhosis.The American Association for the study of Liver Diseases practice guidelines〔J〕.Hepatology，2000;31(4):1005-13.

3 王伟飞，王新颖，岳 辉，等.CD24在大肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖的影响〔J〕.实用癌症杂志，2011;26(1):37-41.

4 庄建良，潘群雄，苏子剑，等.CD24，ALCAM在大肠癌的表达及其临床意义〔J〕.国际病理科学与临床杂志，2007;27(5):382-7.

5 李海飞，魏素菊.CD24与乳腺癌及其干细胞关系的研究进展〔J〕.实用肿瘤杂志，2011;26(2):200-3.

6 Su MC，Hsu C，Kao HL，et al.CD24 expression is a prognostic factor in intrahepatic cholangiocarcinoma〔J〕.Cancer Lett，2006;235(1):34-9.

7 Huang LR，Hsu HC.Cloning and expression of CD24 gene in human hepatocellular carcinoma:a potential early tumor marker gene correlates with p53 mutation and tumor differentiation〔J〕.Cancer Res，1995;55(20):4717-21.