分蘖洋葱ISSR-PCR扩增体系的建立

刘淑芹，吴凤芝，刘守伟，潘 凯

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

分蘖洋葱（Allium cepa L.var.multiplcans Bailey syn.var.Agrogatum Don）为葱科（Alliaceae）葱属（Allium）草本植物，又称毛葱、珠葱，一年生草本葱蒜类蔬菜，是洋葱种质资源重要组成部分[1]。鳞茎中含有特殊辛辣味的挥发性硫化物，具有杀毒消菌作用[2]，种植面积逐年增加。但是现有栽培的分蘖洋葱多为表现良好的品系或农家品种，应用于生产推广的品种很少，加之分蘖洋葱为营养体繁殖，每年种用毛葱的存贮问题，费工费力，效果不佳，在生产上也限制其大面积推广[3]。因此，加速分蘖洋葱的品种筛选与鉴定，促进新品种的繁育以及杂交亲本合理选择选配，进而实现分蘖洋葱种子繁殖是解决问题的关键。而了解分蘖洋葱的遗传背景和DNA指纹图谱构成，确定不同品种的遗传多样性，明确分蘖洋葱资源的亲缘关系和分类地位，是实现这一目标的必要前提。

ISSR（Inter simple sequence repeat）是利用一条包含简单重复序列，并在3'或5'端锚定的寡聚核苷酸引物，对SSR（微卫星）之间一段短DNA序列进行PCR扩增的一种新型分子标记技术[4-7]。由Zietkiewicz等提出并逐渐应用开来，为显性标记，符合孟德尔式遗传规律。相对SSR等其他分子标记方法，操作技术比较简单，获得结果快、成本低[7]，加之其具有分布广泛且变异快的特点，ISSR标记较其他分子标记方法可获得更多基因位点的差异。这些特点使其产生后迅速发展，近年来在多种作物中都有应用，例如水稻、茄子、小麦、柑橘、松树等[8-12]，为作物的DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、特殊基因定位、核心种质保存利用等提供强有力的分子生物学理论基础和技术支撑。

ISSR技术在分蘖洋葱上的应用尚未见报道。本研究以分蘖洋葱叶片DNA为研究对象，对ISSR-PCR扩增体系中退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量以及引物浓度等各因素进行筛选和优化，以期明确适用于分蘖洋葱ISSR分析的最佳反应体系，为ISSR分子标记技术在分蘖洋葱遗传多样性分析、遗传图谱构建、核心种质保存利用等方面的应用提供技术支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

分蘖洋葱品种来自依安、五常、绥化，2010年10月16日在东北农业大学园艺实验站日光温室进行盆栽试验。选择成熟度好、大小均匀一致，无病虫害的分蘖洋葱鳞茎，用10 cm×10 cm的营养钵栽植，每钵栽1株，每品种10株，3次重复，置于全光温室中培养，昼温28℃，夜温15°C，常规栽培管理。于幼苗期（出苗后10～15 d）取分蘖洋葱幼嫩筒状叶片，液氮速冻后于超低温-80℃保存。

ISSR引物由上海生工合成，序列来自加拿大哥伦比亚大学，分别为840：GAGAGAGAGAGAGA GAYT； 809： AGAGAGAGAGAGAGAGG。 Marker采用DL2000，Mg2+、Taq酶等试剂，均为MBI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用植物基因组DNA试剂盒（北京TIANGEN试剂公司）提取植物DNA。分别在260和280 nm处检测所提取基因组DNA的OD值，根据OD260/OD280值判断其纯度，然后再用1.2%琼脂糖凝胶对其进行电泳，在紫外检测仪上观察其纯度并判断DNA分子的大小及浓度一致性[13]。

1.2.2 ISSR-PCR反应参数的优化

以ISSR引物840的Tm值为基础，设置4个退火温度（54、56、58、60℃），采用分蘖洋葱叶片DNA为模板进行PCR扩增，并依据PCR扩增谱带有无和清晰度确定最适引物退火温度。

采用筛选出来的适宜退火温度，对影响ISSR-PCR反应各因素进行优化，进而确定适宜PCR扩增条件。引物为ISSR 809和840，反应总体积为25 μL。其中，DNA模板量设置6个水平：10、20、30、40、50、60 ng；5 mmol·L-1引物浓度设置3个添加量水平:1、2、3 μL；2.5 mmol·L-1dNTP 添加量设置 5个水平:1、2、3、4、5 μL；25 mmol·L-1MgCl2添加量设置5个水平：1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；5 U·μL-1Taq酶用量也设置5个水平：0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL。

1.2.3 ISSR-PCR产物扩增条件及检测方法

PCR产物扩增条件：94℃预变性5 min，随后45个循环，每循环94℃变性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，最后1个循环后72℃延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶（含有机染料Goldenview 0.5 μg·mL-1）中以5 V·cm-1的电压电泳分离，经全自动凝胶成像系统Syngene Gene Genius观察、照像。

2 结果与分析

2.1 引物退火温度对ISSR-PCR扩增反应的影响

试验设置4个退火温度（54、56、58、60℃），进行PCR扩增（见图1）。结果表明，随着引物840退火温度升高，扩增谱带亮度明显提高，其中在54℃时，发生部分条带的缺失；而58和60℃时则出现扩增结果弥散、背景增强的现象。为保证ISSR扩增结果的稳定性和特异性，确定引物最适退火温度为56℃。

2.2 不同PCR参数对ISSR-PCR扩增反应的影响

2.2.1 引物剂量

采用引物809、840对三个分蘖洋葱品种进行PCR扩增，筛选引物（5 mmol·L-1）在体系中最佳剂量。结果表明，在25 μL反应条件下，2～3 μL引物添加量，均可扩增出全部产物，但引物剂量小于2 μL时，PCR扩增产物量很少，谱带带型较弱，而3 μL时扩增产物PCR谱图清晰，扩增完全，多态性好，效果最佳，因此引物在反应体系中最适添加量确定为3 μL（见图2）。

图1 引物退火温度对ISSR-PCR的影响Fig.1 Effect of primer annealing temperature on ISSR-PCR

图2 引物浓度对ISSR-PCR的影响Fig.2 Effect of primer concentration on ISSR-PCR

2.2.2 模板剂量

采用引物840对三个分蘖洋葱品种进行PCR扩增，筛选DNA模板量在体系中最佳用量。结果如图3所示，10～60 ng的DNA模板用量均有PCR扩增结果，但低于20 ng的DNA模板所扩增出来的产物逐渐变少，而高于40 ng的DNA模板未对PCR扩增结果产生本质影响，所以在保证试验结果的前提下，考虑到经济原则，尽量缩减DNA用量，最终确定最适DNA模板量为40 ng。

2.2.3 dNTP剂量

采用引物809、840对三个分蘖洋葱品种进行PCR扩增，筛选dNTP（2.5 mmol·L-1）在体系中最佳用量。高浓度的dNTP易产生错误扩增片段掺入，浓度过高还将出现不扩增现象；但过低的dNTP量，则出现扩增产物量降低的现象。由图4可看出，1～5 μL的添加量中，3 μL的dNTP即可扩增出全部产物，且条带清晰，无拖尾等问题。最终确定最适dNTP量为3 μL。

2.2.4 Mg2+浓度的确定

Mg2+浓度是影响PCR扩增的重要因素，它的含量多少直接影响PCR扩增的特异性和产量[11]。通常情况下，Mg2+浓度的增加可提高PCR产物量，且伴有非特异性扩增的产生，最终降低结果的真实性。

图3 DNA模板量对ISSR-PCR的影响Fig.3 Effect of DNA concentration on ISSR-PCR

图4 dNTP浓度对ISSR-PCR的影响Fig.4 Effect of dNTP concentration on ISSR-PCR

图5为Mg2+浓度在体系中不同添加量的筛选结果，1.5 μL的Mg2+浓度，PCR扩增不完全，谱带少，产量低；随Mg2+添加量的不断增加，扩增样品的背景也不断加深，引物840在3.0 μL的Mg2+浓度时出现了明显的带型弥散现象。为保证结果确定2.0 μL的Mg2+为最适用量。

2.2.5 Taq酶用量的确定

Taq酶用量是影响PCR反应的另一个重要因素，其对扩增产物的产量有直接影响[11]。本试验中Taq酶用量设置为0.2～0.6 μL。扩增结果见图6，从0.2～0.6 μL各用量Taq酶均可扩增出谱带，且随着酶用量的增多，扩增产物清晰度和产量均有所升高。但高浓度（0.5、0.6 μL）Taq酶用量反而扩增出较弱的带型。本着确保最佳效果和最低成本原则，确定Taq酶最佳用量为0.4 μL。

2.3 ISSR-PCR优化体系的应用

将筛选后的各条件进行组合，采用引物809和840对三个分蘖洋葱品种进行PCR扩增，检测优化体系的适用性。结果见图7，两个ISSR引物对三个分蘖洋葱品种扩增出的条带清晰、重复性好，而且只采用ISSR 809即可将三个分蘖洋葱品种加以区别，表明优化后的PCR反应体系稳定可靠，可在分蘖洋葱品种的遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究中应用。

图5 Mg2+浓度对ISSR-PCR的影响Fig.5 Effect of Mg2+concentration on ISSR-PCR

图6 Taq酶用量对ISSR-PCR的影响Fig.6 Effect of Taq DNA polymerase on ISSR-PCR

图7 引物809和840的PCR扩增结果Fig.7 ISSR-PCR results of prime 809 and 840

3 讨论与结论

合适的体系反应参数是进行良好ISSR-PCR扩增的首要前提[11]。其中，DNA模板量是影响反应条件的重要因素之一，具有纯度高、质量好的DNA模板才能有效进行PCR扩增。一般认为具有1.6～1.9吸光值（A260/A280）DNA才能符合基本扩增需要，需注意的是DNA提取后存放时间过久，DNA的降解会导致扩增失败；Mg2+浓度是第二个重要因素，它对Taq酶活性具有绝对性的影响，从而制约着PCR扩增产物量，其浓度对Taq酶具有双重作用，低浓度时，不能对酶起到活化作用，高浓度反而会使酶活性产生抑制作用；引物浓度为第三个因素，总体原则是适量使用，因其在体系中量过少，会引起PCR扩增产物少，并出现扩增谱带弱，亮度不达标现象，而量过多时将会产生非特异性谱带；第四个重要因素是dNTP的浓度，作用效果类似于引物浓度，dNTP的浓度过低，扩增产物偏少，条带亮度不够，扩增不完全，浓度过高时，产生错误扩增条带的渗入，干扰正常的PCR结果。为此，要本着确保扩增完全，谱带清晰，多态性良好，且具有较好重复性，兼顾低成本的原则，构建合适的ISSR-PCR反应体系。

本试验对影响ISSR-PCR扩增反应的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA量和退火温度的最佳条件进行筛选和优化，初步建立适合分蘖洋葱植物ISSR反应体系，即DNA模板量40 ng（2 μL）， 10 × PCR Buffer 3 μL， Mg2+（2.5 mmol·L-1）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1） 3 μL，引物（5 mmol·L-1）3 μL，Taq 酶（5 U·μL-1）0.4 μL，最适退火温度为56℃。扩增反应条件为：94℃预变性5 min，随后45个循环，每循环94℃变性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，最后1个循环后72℃延伸10 min。

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