长期定位施肥黑土富里酸与Cu（Ⅱ）配位能力的研究

魏自民，赵富阳，魏 丹，周宝库，李艳平，李书玲

（1.东北农业大学大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境研究所，哈尔滨 150086）

长期定位施肥试验是指超过20年研究作物生产、养分循环和农业环境效应的田间试验[1]。它能克服短期培肥试验受当年环境因素影响，为探讨施入土壤中磷肥和有机肥的转化、去向、有效性、消耗和积累等提供技术条件。腐殖酸广泛存在于土壤、水和沉积物中，是一种含有多功能基的聚电解质，具有相当量的多种离子与放射性核物质[2-5]结合能力，对各种金属离子在自然界中的迁移、固定和聚集有重要作用[6]。目前已有高效液相色谱、离子选择电极、荧光光谱分析等多种研究方法[7]应用于对有机质与重金属作用的研究。由于荧光光谱法具有灵敏度高、快速、定性、定量、实验易于操作等特点，且在水溶液中浓度低条件下易被检测到，被广泛应用于腐殖酸领域的研究。国内外对于不同来源的FA分子与重金属离子间相互反应的研究报道比较多[8-10]，但对经过长期定位施肥后黑土FA于Cu（Ⅱ）之间相互作用关系报道较少。本研究运用荧光光谱分析方法，对经过长期施加不同肥料的黑土中的FA与Cu（Ⅱ）的络合能力进行分析，以期研究长期施加不同肥料对黑土性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验土壤样品于2009年5月取自黑龙江省农业科学院，试验分4个施肥处理，分别为CK、NPK（无机肥处理）、MNPK（有机无机肥混施处理）、OM（有机肥处理）。试验田2009年已达30个生长季。1980年按小麦-大豆-玉米顺序轮作，每个处理小区面积168 m2，每区8垄，垄长30 m，垄距70 cm。对小麦和玉米施肥量为：N 150 kg·hm-1，P2O575 kg·hm-1，K2O 75 kg·hm-1；对大豆施肥量为：N 75 kg·hm-1，P2O5150 kg·hm-1，K2O 75 kg·hm-1；有机肥为纯马粪，每轮作周期施一次，施于玉米茬，按氮量75 kg·hm-1（约马粪18.6 t·hm-1），以M表示。氮肥为尿素，磷肥为重过磷酸钙、磷酸氢二铵，钾肥为硫酸钾。

1.2 土壤富里酸（FA）的提取

1.2.1 腐殖质的提取

样品大约30 g用0.1 mol·L-1Na2P2O7+0.1 mol·L-1NaOH的混合液按固液比1∶5振荡（150 r·min-1）浸提24 h，0.45 μm纤维树脂滤膜，收集滤液。

1.2.2 FA的分离纯化

将1.2.1中滤液用6 mol·L-1HCl将pH调至1.0，在4℃中静置过夜后，过滤后过0.45 μm纤维树脂滤膜，得上清液及沉淀，上清液过XAD8-HP大孔吸附树脂及氢型阳离子交换树脂后，得FA组分。

1.2.3 FA与Cu（Ⅱ）配位反应平衡液制备

取8个50 mL锥形瓶，每瓶中均加入15 mg·L-1所制备滤液20 mL，分别滴加浓度为0.01 mol·L-1或0.001 mol·L-1Cu（NO3）2溶液，8 个锥形瓶中的 Cu（Ⅱ）浓度依次为0、10、20、30、40、50、60、70 μmol·L-1，使用两种浓度（0.1 mol·L-1和0.01 mol·L-1）的HClO4和NaOH溶液调各样品pH为8.0±0.05，加入的酸碱试剂总量不超过100 μmol，忽略浓度稀释效应，在恒温震荡器中30℃、180 r·min-1避光震荡24 h，相同温度下再避光静止4 h，待反应平衡后，进行光谱测定。

1.3 光谱学分析

1.3.1 荧光光谱测定

荧光光谱测定采用仪器为Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS50B。该仪器的主要性能参数如下：激发光源：150-W氙弧灯；PMT电压：700 V；信噪比＞110；带通（Bandpass）：Ex=10 nm；Em=10 nm；响应时间：自动；扫描光谱进行仪器自动校正。各荧光光谱的扫描参数：荧光发射光谱：发射波长扫描范围为Eem=250～750 nm，固定激发波长Eex=360 nm；荧光激发光谱：激发波长扫描范围为Eex=370～600 nm，固定发射波长Eem=560 nm；同步扫描光谱：波长扫描范围为Eex=200～600 nm，Δλ=Eem-Eex=18 nm，上述三种传统荧光光谱测定时的扫描速度均为200 nm·min-1。

1.3.2 荧光猝灭方程计算配位比例系数及表观稳定常数计算

利用修正型Stern-Volme方程[11-12]：F0/（F0-F）=1/（fK[Cu]）+1/f，其中f是能与Cu离子结合的荧光基团的比例，K是络合反应的表观稳定常数，F0为初始荧光强度，F为猝灭后的荧光强度。在上式中如F0/（F0-F）与1/[Cu]成线性关系可求出表观稳定常数K和参加配位的荧光基团比例f。

2 结果与分析

2.1 FA与Cu（Ⅱ）相互作用的传统荧光光谱特性

2.1.1 发射光谱

由图1可以看出，不同处理荧光发射光谱图谱形状较为类似。但各峰强度不同，相似的荧光基团以不同比例存在于各处理FA分子中。在扫描波长范围内，随着溶液中Cu（Ⅱ）浓度升高，FA荧光强度依次下降。加入Cu（Ⅱ）后440 nm主峰未发现明显位移。低浓度Cu（Ⅱ）可明显起到对FA的荧光猝灭效应，而当Cu（Ⅱ）浓度达到一定程度时反应趋于达到平衡。与CK处理相比较施肥后低浓度的Cu（Ⅱ）更能起到对FA荧光猝灭作用，特别是M，MNPK处理在Cu（Ⅱ）浓度达到60 μmol·L-1时反应已明显接近饱和，长期定位施肥后（特别是施加M，MNPK肥）土壤FA与Cu（Ⅱ）间反应更强烈。

图1 各处理FA与Cu(Ⅱ)离子作用的发射光谱Fig.1 Emission spectrum of each FA after Cu(II)added

2.1.2 激发光谱

由图2可知，不同处理图谱形状基本相似，均在458、392 nm附近各产生一个荧光峰。392 nm处的荧光峰与木质素降解产物酚结构上的羟基有关，458 nm处荧光峰来源于苯环上的供电子基团（-OH、-NH2等），加入Cu（Ⅱ）后，392、458 nm处荧光强度剧烈下降，表明FA中的-OH、-NH2等基团与Cu（Ⅱ）发生强烈反应。低浓度Cu（Ⅱ）可对FA荧光猝灭效果，而当Cu（Ⅱ）浓度达到一定程度时反应趋于平衡。施肥后458 nm荧光峰猝灭现象较392 nm荧光峰的猝灭现象剧烈，这表明施肥后FA的偏复杂结构（苯环上的供电子基团：-OH、-NH2）与Cu（Ⅱ）间发生较强烈的反应。

2.1.3 同步扫描光谱

由图3可见，加入Cu（Ⅱ）后470、430、390 nm主峰没有发现明显的位移。低浓度Cu（Ⅱ）可明显起到对FA的荧光猝灭效应，而当Cu（Ⅱ）浓度达到一定程度时反应趋于达到平衡。Cu（Ⅱ）浓度为10 μmol·L-1时所有处理FA分子的470 nm峰下降得均较明显，当Cu（Ⅱ）浓度继续升高时施肥后的FA 470 nm峰的猝灭现象更为显著（在Cu（Ⅱ）浓度达到70 μmol·L-1时此峰趋于消失），尤其是施加MNPK肥后470 nm峰由最高峰降为最低峰，这表明施肥后（尤其是施加MNPK肥）FA分子中的偏复杂结构能与Cu（Ⅱ）发生较强烈反应。

2.2 猝灭类型的确定

静态猝灭发生于猝灭剂与荧光物质的基态分子间。静态猝灭改变了荧光物质的荧光特性而造成激发光谱的位移。加入Cu（Ⅱ）后392、458 nm主峰没有发现明显的位移，意味着Cu（Ⅱ）与FA的络合反应属于动态猝灭（见图4）。

2.3 荧光猝灭方程

表1为根据动态猝灭方程计算出的Cu（Ⅱ）与FA分子间的配位表观稳定常数及配位比例系数。

Cu（Ⅱ）与各处理FA的配位比例由高至低顺序为：MNPK（0.95）＞NPK（0.93）＞M（0.92）＞CK（0.81），与CK相比较MNPK处理后的FA与Cu（Ⅱ）的配位比例提高了17.2%，NPK处理后的FA与Cu（Ⅱ）的配位比例提高了14.8%，M处理后的FA与Cu（Ⅱ）的配位比例提高13.6%。以上数据表明施肥（特别是施加MNPK肥）有更多Cu（Ⅱ）可结合到FA分子。

图2 各处理FA与Cu(Ⅱ)离子作用的激发光谱Fig.2 Excitation spectrum of each FA after Cu(II)added

图3 各处理FA与Cu(Ⅱ)离子作用的恒波长同步光谱Fig.3 Sy spectrum of each FA after Cu(II)added

Cu（Ⅱ）与各处理FA反应的表观稳定常数由高至低顺序为：M（0.043）＞NPK（0.043）＞CK（0.035）＞MNPK（0.020）。与CK相比较M，NPK处理后的FA与Cu（Ⅱ）反应的表观稳定常数提高了22.8%，而MNPK处理后的FA与Cu（Ⅱ）反应的表观稳定常数降为原来的57.1%。施加M或NPK肥料均提高Cu（Ⅱ）与土壤FA分子间反应的表观稳定常数即Cu（Ⅱ）与土壤FA分子间的反应更为稳定，而当施加MNPK肥料时土壤FA与金属离子间的表观稳定常数降低。

图4 温度对FA与Cu(Ⅱ)间反应能力的影响Fig.4 Effect of temperature on the reactivity ability between FA and Cu(Ⅱ)

表1 加入离子后FA的配位比例与表观稳定常数Table1 Coordination ratio and stability constant of FA after Cu(II)added

3 结论

a.与CK处理相比较施肥后低浓度的Cu（Ⅱ）对FA荧光猝灭作用更强，特别是M、MNPK处理在Cu（Ⅱ）浓度达到60 μmol·L-1时反应已明显接近达到饱和，这意味着经长期定位施肥后（特别是施加M，MNPK肥）土壤FA与Cu（Ⅱ）间的反应更加强烈。

b.激发光谱显示施肥后458 nm荧光峰的猝灭现象较392 nm荧光峰的猝灭现象剧烈，这表明施肥后FA的偏复杂结构与Cu（Ⅱ）间发生较强烈反应。

c.同步扫描光谱显示在Cu（Ⅱ）浓度较高时施肥后的FA470 nm峰的猝灭现象更为显著（尤其是施加MNPK肥后470 nm峰由最高峰降为最低峰），这表明施肥后（尤其是施加MNPK肥）FA分子中的偏复杂结构能与Cu（Ⅱ）发生较强烈的反应。

d.施加NPK肥料即可提高FA与Cu(Ⅱ)间的配位比例系数又可提高二者间的表观稳定常数，亦表明有更多的Cu（Ⅱ）离子能够更加稳定的结合到长期施用NPK肥料后的FA分子上。

e.虽然施加MNPK肥料的FA与Cu（Ⅱ）间的配位比例系数最高，但二者间反应的表观稳定常数明显下降，这意味着施加MNPK肥料后的FA能够结合Cu（Ⅱ）的数量最多，但二者的结合并不稳定。

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