鹅膏菌产抑菌物质培养条件优化及安全性分析1)

冀瑞卿 李 玉

(吉林农业大学，长春，130018)

宋瑞清

(东北林业大学)

鹅膏属(Amanita)真菌隶属于伞菌亚纲(Agaricomycetidae)、伞菌目(Agaricales)、鹅膏科(Amanitaceae)［1］，其绝大多数是专性菌根菌，与松科、壳斗科、桦木科以及杨柳科的许多植物建立共生互惠的外生菌根关系［2］。鹅膏菌有很多是美味的食用菌，如:Amanita esculenta Hongo＆Matsuda，橙盖鹅膏菌(Amanita caesarea(Scop.:Fr.)Pers.ex Schw.)等［3］，但是有毒鹅膏菌更引人关注。对于鹅膏菌有毒物质及其毒理的研究颇受毒理学、化学、生物学和医学等研究人员的重视，至今已有100多年的研究历史。目前已分离鉴定的鹅膏菌毒素有多种［4－6］。将鹅膏菌的活性物质用于有害生物的防治也有记载［7］，如Amanita muscaria 就是因其对苍蝇有毒而得名毒蝇鹅膏［8］，鹅膏菌的抑菌物质对病虫害的防治效果也很显著［9－11］，然而在将其应用到实践中与环境条件的适应性怎么样?对环境能够造成多大的影响等一系列的问题还需要更深入的研究，笔者就鹅膏菌菌株AV抑菌物质的最佳营养条件和非营养条件、对温度和紫外线的敏感问题，以及通过小鼠试验对鹅膏菌菌株AV抑菌物质对环境的安全性进行研究，保证其应用的生态安全性，在控制植物病原菌的同时不危害人类或其他生物的生长代谢，为其进一步的推广奠定理论依据。

1 材料与方法

试验菌株:鹅膏菌菌株AV由东北林业大学病理教研室提供;试验动物为昆明种小鼠，体质量(19.15±0.15)g，雌、雄各半，购自黑龙江省肿瘤医院动物试验中心。

试验用培养基及其配方:①基础培养基。葡萄糖 20.0 g，马铃薯 200.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，琼脂 20.0 g，水 1000.0 mL，自然 pH 值。②碳源培养基。各种碳源 20.0 g，蛋白胨 2.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000.0 mL，自然 pH 值。③氮源培养基。各种氮源 2.0 g，葡萄糖 20.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000.0 mL，自然 pH 值。④改良PD培养基。葡萄糖20.0 g，马铃薯200.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000 mL，自然 pH 值。

培养方法:切取PDA平板培养7 d的同质等量的菌片接种到盛有300 mL改良PD培养基的三角瓶(500 mL)中，置旋转式摇床160 r/min、25℃培养15 d(小菌球布满培养瓶)。按等湿重接种法接种，接含1 g湿菌球的二级种培养液到液体培养基中，设3个重复，摇床培养160 r/min、25℃、7 d。

评价指标:①发酵液菌丝生物量。由菌丝干质量确定。②抑菌物质活性。将发酵液进行超声波处理后，利用紫外—可见光分光光度计在226、218 nm下比色测定抑菌物质活性［12］，对照为相对应的液体培养基。

试验设计:①营养因子的单因子试验。分别以各碳源或氮源培养基为培养基质，二级种为种子液，接种量为10%，装液量为75%，pH自然。摇床培养160 r/min、25℃、7 d，收集菌丝，通过生物量和比色值确定最佳营养元素。②营养因子的正交试验。5因子4水平的因子水平表设置如表1。以二级种为种子液，接种量均为10%，装液量为75%，pH自然，摇床培养(160 r/min，25℃)7 d，收集菌丝，通过生物量和比色值确定营养元素间的影响作用。③不同环境因素的影响。以正交试验确定的最佳培养基①为培养基，二级种为种子液，各影响因素的梯度设定如下:pH 为 4、5、6、7、8、9;装液量为 30、50、75 mL;接种量为 0.75%、1.00%、1.25%;培养时间为 7、15、20 d;培养温度为15、18、25、30、35、40 ℃;摇床转速为 60、80、120、140、160、180 r/min，摇床培养 7 d，收集菌丝，通过生物量和比色值确定最佳培养条件。

分离物Ⅳ［13］对环境的耐受性分析:①对温度敏感性。分别在 25、35、45、55、65、75、85、100 ℃下处理分离物Ⅳ2 h，在226、218 nm下比色测定抑菌物质活性。②对紫外光的敏感性。分离物Ⅳ在紫外灯下分别照射0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h 后分别比色测定抑菌物质活性。③对酸碱度的敏感性。分别用6 mol/L HCl和6 mol/L NaOH调酸碱度，使分离物Ⅳ的 pH 值为 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，分别进行比色测定抑菌物质活性。

表1 鹅膏菌菌株AV培养因子的L16(45)正交试验因素水平 g·L－1

菌株AV抑菌物质对环境中其他生物的影响:①小鼠急性毒性试验。采用口服菌丝体方式饲喂小鼠。给药前禁食16 h，不禁水。菌丝体分为4个剂量组(表7)。每剂量组饲喂10只小鼠。给药后观察小鼠的反应情况，记录中毒症状和死亡情况;试验之前作预试验确定致死范围。②小鼠异常毒性试验。采用皮下注射的方式进行试验，将菌株AV粗提液(分离物Ⅳ)冷冻干燥的粉末用无菌生理盐水配制成质量浓度为2 g/L的溶液备用。粗提液给药质量浓度为 0.06、1.00、2.00 g/L，分离物Ⅳ给药质量浓度为 0.02、0.06、0.10、1.00、2.00 g/L。给药剂量为每只小鼠每天0.5 mL，每剂量组10只小鼠，观察7 d，对照为正常饲喂小鼠。采用改进寇氏法［14］计算LD50。

2 结果与分析

2.1 营养因子对抑菌活性的影响

2.1.1 营养因子的单因子试验

不同碳源、氮源对生物量及抑菌活性的影响不同(表2)。菌株AV利用较好的碳源是乳糖、蔗糖和葡萄糖，在这3种碳源培养基中，菌丝体生物量间无显著差异。从吸光度来看，以乳糖为碳源的提取液在226、218 nm下均最高。因此将乳糖作为菌株AV菌丝生长的最佳碳源。

表2 营养元素对鹅膏菌菌株AV的生物量和抑菌物质活性的影响

从菌丝体生物量来看，乙酸铵、天门冬氨酸和蛋白胨是菌株AV生长利用很好的氮源;以蛋白胨为氮源的提取液在226、218 nm下的吸光度最大，即抑菌活性物质的含量较高。因此将蛋白胨作为菌株AV菌丝生长的最佳氮源。

2.1.2 营养因子的正交试验

由极差来看，对菌株AV生物量影响最大的是MgSO4的用量，其次是乳糖、KH2PO4、蛋白胨，但方差分析表明，4种营养元素对生物量影响结果在α=0.05下无显著差异(表4)。而以抑菌活性物质吸光度(226、218 nm)为衡量指标进行的正交分析显示(表 3)，影响因素由主到次是乳糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨，方差分析结果(表4)表明4个因素中乳糖是影响菌株AV抑菌活性物质含量的最重要因素，与其他的3个因素有显著性差异(α=0.05)，其他3个因素间无显著差异。最佳组合为:①乳糖30.0 g/L，蛋 白 胨 0.50 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO44.5 g/L;②乳糖 10.00 g/L，蛋白胨 0.50 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L，蛋白胨 2.0 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L。

表3 鹅膏菌菌株AV各营养因子正交试验的直观分析结果

表4 鹅膏菌菌株AV各营养因子正交试验的方差分析结果

2.2 培养环境因子对抑菌活性的影响

表5显示了培养环境因子对于菌株AV菌丝生物量和抑菌活性物质活性的影响情况。其生物量和抑菌物质的含量最高的培养条件为:pH值5～6，温度25℃，接种量1.25%，装液量50%，摇床转数180 r/min，培养时间 20 d。

2.3 粗提物Ⅳ对于不同培养环境的耐受性

由表6可见，温度对菌株AV抑菌活性物质活性影响较大。随着温度的升高，抑菌活性物质活性降低。25～65℃对粗提物Ⅳ活性的影响比较小，之间无显著性差异(α=0.01);温度超过75℃时，菌株AV抑菌活性物质活性急速下降，与前几个温度处理形成显著差异;在100℃时，几乎检测不到活性。紫外照射对菌株AV抑菌活性物质活性有一定的影响。

表5 不同培养环境下鹅膏菌菌株AV的生物量和抑菌活性

随着照射时间的增加，抑菌物质活性逐渐下降，紫外照射4 h以下对活性影响较小，4 h前的处理间无显著差异(α=0.01)，但4～8 h照射后活性下降比较快，其活性分别与前几个照射时间的活性呈显著差异(α=0.01)。pH值对菌株AV抑菌活性物质活性影响较大。pH值6～7，抑菌活性物质活性稳定;pH＜6(或者pH﹥7)，随着pH降低(或增加)，抑菌活性物质活性急速下降，之间形成显著性差异(α=0.01);酸碱对抑菌物质的活性都有影响，尤其是pH＜5或者pH＞5时活性下降更快。

表6 不同环境因子对鹅膏菌菌株AV抑菌物质活性的影响

2.4 小鼠急性毒性分析

用鹅膏菌菌株AV菌丝体饲喂小鼠LD50为418.70 mg/kg，95%可信限为 453.11 ～ 386.90 mg/kg。具体试验结果见表7。

表7 鹅膏菌菌株AV菌丝体的小鼠急性毒性试验结果

2.5 小鼠异常试验结果

前期抑菌试验结果表明，粗提液及分离物Ⅳ抑菌效果最好的最高质量浓度为0.06 g/L［13］，将这个质量浓度分别减小或加大对小鼠进行皮下注射试验10 d，其质量浓度加大到2 g/L也没有危及小鼠生命，而且小鼠体质量明显增大。10 d后解剖结果表明:粗提液为2 g/L时，小鼠内脏未发现异常;分离物Ⅳ2 g/L时，小鼠内脏有异常变化(表8)。所以安全剂量应小于2 g/L。此质量浓度比实际抑菌所用的高30多倍，因此，将鹅膏菌菌株AV抑菌活性物质(粗提液或分离液Ⅳ)用于杨树烂皮病［13］的防治对生态安全。

3 结论与讨论

通过最佳培养基及其最佳培养环境的选择得到鹅膏菌菌株AV最适的培养条件:最佳碳源为乳糖，最佳氮源为蛋白胨，而且在供试的几种营养元素中，碳源是影响菌株AV生物量及其抑菌物质产生的最主要因素。最佳培养基组合为:①乳糖30.0 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO44.5 g/L;②乳糖10.00 g/L，蛋白胨 0.50 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L。产生抑菌活性物质最适合培养条件为:pH值5～6，温度25℃，接种量1.25%，装液量50%，摇床转数180 r/min，培养时间20 d。

表8 鹅膏菌菌株AV粗提液和分离物Ⅳ对小鼠的影响

比色测定时，226、218 nm下结果一致，抑菌物质化学结构还需更进一步试验证明，但初步认为是酰胺类物质［11］，在水溶剂中发色团可能是烷基［12］。对极端环境的敏感性分析的结果显示，分离物Ⅳ在环境中相对比较稳定，但是在温度超过75℃，pH大于9或小于4时，或者紫外照射时间超过4h会影响其抑菌物质活性。正常的试验条件下抑菌活性对温度和光照的稳定性比较好，对酸碱度比较敏感;但是从另一个角度考虑，在实践应用中此物质会不会造成高残留对环境造成影响，还需进一步的深入研究。小鼠的毒性试验结果表明，抑菌物质质量浓度在2 g/L以内对小鼠无影响，可见在实际应用时控制抑菌物质的质量浓度非常重要。

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