高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM～92株）免疫效果与安全性试验报告

包新奇，陈昌海，程雷，高升，徐正军，徐小艳， 刘耀兴，李百忠，陈建英.3，张晨飞

（1.江苏省动物疫病预防控制中心，江苏南京 210036；2.江苏省如皋市畜牧兽医站，江苏如皋 226572；3.拉萨市动物疫病预防控制中心，西藏拉萨 850000）

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM～92株）免疫效果与安全性试验报告

包新奇1，陈昌海1，程雷1，高升1，徐正军1，徐小艳1， 刘耀兴1，李百忠2，陈建英1.3，张晨飞1

（1.江苏省动物疫病预防控制中心，江苏南京 210036；2.江苏省如皋市畜牧兽医站，江苏如皋 226572；3.拉萨市动物疫病预防控制中心，西藏拉萨 850000）

目前我国控制高致病性猪蓝耳病主要采取以疫苗免疫为主的综合性防控措施，并将高致病性猪蓝耳病列为强制免疫的4个疫病之一。为了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-92株）免疫效果与安全性，我们开展了该活疫苗的有关试验，现将试验结果报告如下。

一、材料与方法

（一）试验用疫苗高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-92株），生产批号2010005，生产日期2010-02-06，由新疆天康畜牧生物技术有限公司提供。

（二）试验用猪试验在江苏省如皋市某猪场进行，随机选择3～4周龄仔猪160头。

（三） 试剂

1.猪蓝耳病抗体检测。猪蓝耳病抗体检测ELISA试剂盒，批号40959-4201，有效期2011.6.30，由美国IDEXX公司提供。

2.高致病性猪蓝耳病病原检测。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp2 1594～1680变异株）RTPCR检测试剂盒，批号20100806P，由北京世纪元亨公司提供。

（四）试验设计

1.疫苗免疫效果试验。随机选择3～4周龄仔猪40头，按使用说明书剂量，颈部肌肉注射30头，1头份/头，耳标标号，同时设对照组10头，不接种疫苗，耳标标号。免疫前采集试验组猪血清20份，对照组猪血清6份，用于检测高致病性猪蓝耳病病原和抗体。免疫后14天、28天、2个月、3个月、4个月，分别采集试验组20份猪血清和对照组6份猪血清，检测高致病性猪蓝耳病免疫抗体，进行免疫效果评价试验。

2.疫苗安全性试验。随机选择3～4周龄仔猪10头，按使用说明书剂量的10倍量（10头份/头）颈部肌肉注射，耳标标号。免疫后观察21 d，观察内容包括全身皮肤、精神状况、食欲、体温及注射局部反应等，进行安全性试验。

3.疫苗普免试验。随机选择3～4周龄仔猪100头，按使用说明书剂量，颈部肌肉注射，1头份/头，耳标标号。免疫后观察21 d，观察内容包括全身皮肤、精神状况、食欲、体温及注射局部反应等，进行普免试验。

（五）试验方法

1.猪蓝耳病血清抗体检测。采用猪蓝耳病抗体检测ELISA试剂盒检测PRRS抗体，主要操作步骤与结果判定如下：

⑴ 取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。

⑵ 在C1、D1的 PRRS孔和C2、D2的NHC孔内分别加入 100μl 没有稀释的阴性对照。在 A1、B1的 PRRS孔和 A2，B2 的 NHC孔内分别加入100μl 没有稀释的阳性对照。

⑶ 在相邻的 PRRS 和 NHC 孔内分别加入100μl 按1：40稀释好的样本。所有样品均按此原则加 2孔。

⑷ 室温下孵育30 min。

⑸ 吸取各孔的液体弃入废液筒。用大约300μl 磷酸缓冲洗涤液洗涤板孔，重复 3～5 次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。注意应避免包被板孔干燥。在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上。

图1 接种疫苗后猪群体血清抗体转阳情况

图2 免疫后不同时间猪群抗体阳性率的变化情况

⑹ 每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记的抗猪抗体。

⑺ 室温下孵育30 min。

⑻ 重复步骤“⑸”。

⑼ 每孔加入100μl TMB 底物液。

⑽ 室温下孵育15 min。

⑾ 每孔加入100μl 终止液，使反应终止。

⑿ 测量并且记录样本和对照的 A(650），计算结果。

⒀ 结果判定：①如果 S/P 值低于0.4，样品判定为 PRRS 抗体阴性；②如果 S/P 值大于或等于 0.4，样品判定为 PRRS 抗体阳性。

2.高致病性猪蓝耳病病原检测。采用猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nep2 1594～1680变异株）RTPCR检测试剂盒检测，主要操作步骤与结果判定如下。

⑴ 样品处理：每份样品分别处理。

组织样品：称取组织样品0.05 g研磨后加1.5 ml生理盐水继续研磨，转至1.5 ml灭菌离心管中，8 000 rpm离心2 min，取上清100 ul于1.5 m灭菌离心管中。

全血样品：待血凝后离心取血清100 ul，置1.5 ml灭菌离心管中。

阳性对照：取阳性对照100 ul，置1.5 ml 灭菌离心管中。

阴性对照：取阴性对照100 ul，置1.5 ml 灭菌离心管中。

⑵ 病毒RNA提取：取已处理的样品及阴、阳性对照，分别加入裂解液600 ul，充分颠倒混匀，室温静置3～5 min。

将液体吸入吸附柱中，13 000 rpm离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。

再次向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。再空柱离心2 min。

将吸附柱移入新的1.5 ml离心管中，在膜中央加入洗脱液25 ul，室温静置1 min，13 000 rpm离心30s，弃去吸附柱，获得总RNA备用。

⑶ RT～PCR操作程序

每 份 总 体 积20 uL， 含16.8 uL RT～PCR反 应 液，1.2 uL 酶混合液，2 uL 模板RNA。

在PCR扩增仪上进行以下程序：42℃ 45 min，94℃ 3 min；扩增条件为 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸7 min。

⑷ 电泳：在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糠凝胶，待凝固后将PCR产物10 ul点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120 V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

⑸ 结果判定：阳性对照出现278 bp扩增带、阴性对照无带出现时，实验结果成立。被检样品出现278 bp扩增或200 bp扩增为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp21594～1680变异株）阳性，否则为阴性。

二、实验结果

1.高致性猪蓝耳病病原检测结果。疫苗免疫前，试验猪和对照猪经高致病性猪蓝耳病病原RT～PCR检测，均为阴性。

2.疫苗安全性试验结果。按疫苗使用说明书剂量的10倍量接种后，观察21 d，所有猪只精神、食欲、体温均正常，注射局部无不良反应，表明该疫苗安全性好。

3.疫苗免疫试效果试验。

⑴免疫后不同时间检测猪群血清转阳情况，见图1。由图1可知，活疫苗免疫后14天群体即有血清抗体转阳猪只出现，随后猪群血清抗体转阳逐渐增多，S/P值也随之增大；至90天时S/P值平均值达最大，120天时仍维持在2.15。

⑵免疫后不同时间猪群抗体阳性率的变化情况，见图2。由图2可知，猪群免疫后14天，群体抗体阳性率为50%，以后阳性率逐渐增高，到90天时达100%，120天时仍维持在100%的抗体阳性率，说明疫苗免疫效果好，抗体阳性率维持时间长。

三、讨论

1.本试验使用IDEXX公司生产的PRRS抗体检测试剂盒检测疫苗免疫后血清抗体水平，其S/P值的高低可以反映血清抗体的水平，进而反映疫苗免疫效果。由血清抗体检测结果可知，该活疫苗免疫后14 d即可检测出血清抗体转阳，说明该疫苗免疫抗体产生快，而且随后S/P值不断增加，说明血清抗体浓度不断增加，到90 d时，S/P值达2.31，这时抗体效价最高，至120天时，S/P值仍为2.15。说明高浓度血清抗体维持时间长，疫苗免疫效果好。

2.血清抗体阳性率是反应疫苗免疫后群体抗体状态的一个重要数据，群体血清抗体阳性率高，维持时间越长，说明疫苗免疫效果越好，本次试验结果同样说明该疫苗免疫效果好。

3.疫苗的安全性试验说明该疫苗对3～4周龄仔猪安全。

4.根据本次试验结果，仔猪到育肥猪推荐的免疫程序如下：仔猪3～4周龄接种，1头份/头，至肥猪5个月出栏。

（略）