阿托伐他汀对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞体外干预后Toll样受体2、Toll样受体4的表达变化研究

毋 静，梁婉怡，邓家鑫，曲 源，于清宏

南方医科大学珠江医院风湿免疫科，广州 510280

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种常见的炎症性疾病，它以骶髂关节和脊柱慢性炎症为主要表现。AS由于其低下的生活质量和较高的致残率而受到众多关注。AS的治疗仍然是全世界风湿病学家面临的难题，其难点之一是缺乏有效的治疗药物，传统的改善病情抗风湿药物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs） 治疗 AS 的疗效有限，众多风湿病学专家也致力于新研究药物的开发和应用，以寻找更有效的抗炎药物。Yokota等[1]研究表明他汀类药物可下调类风湿关节炎患者由TNF-a引起的IL-6 和IL-8 的增高。Nagashima等[2]研究显示他汀类药物可以促进类风湿关节炎患者滑膜细胞的凋亡，而且极有希望被用于治疗类风湿关节炎[3]。他汀类药物已经在临床显示出其有效的抗炎作用，由于此类药物可以减弱脂多糖的作用，专家们认为其是通过抑制天然免疫起作用的[4]。本研究通过观察天然免疫分子 Toll样受体 2（TLR-2）、Toll样受体 4（TLR-4）在 AS患者外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的mRNA水平表达以及阿托伐他汀体外干预AS患者PBMC的研究，观察Toll样受体（TLRs）的表达差异，探讨AS治疗的可能的突破点，寻找新的治疗AS的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

患者30例，其中，男27例，平均年龄30.6岁；女3例，平均年龄28.6岁，均为风湿免疫科住院AS患者，将其作为AS患者组，均符合1984年修订的纽约诊断标准[5]，病情活动期，得到患者同意后抽取肘静脉血12 ml，EDTA抗凝，置4℃保存，另选取健康志愿者30例作为健康志愿者组，两组年龄、性别等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。阿托伐他汀药物原粉由北京红惠公司赞助。RT-PCR引物由上海生物有限公司合成。

1.2 方法

①取4ml静脉血缓慢加于淋巴细胞分离液上面，2000 r/min，离心20 min。用尖细玻璃管缓慢将分离到的中间层PBMC转入离心管，PBS洗涤2次。离心管底可见白色沉淀，在沉淀中加1.0 ml的Trizol。反复抽吸匀浆液以剪切基因组DNA，将样品转移到无菌 1.5 ml离心管中，12 000 r/min，4℃，5 min。上清加入200 μl氯仿，剧烈振荡混匀30 s。室温放置5 min，12 000 r/min，4℃，10 min。重复上一步骤，吸取上清至另一1.5 ml离心管里加入等体积的异丙醇，混匀静置数分钟。12 000 r/min，4℃，离心10 min。 用70%酒精洗涤沉淀2次，真空离心干燥3～5 min，沉淀用30～50 μl DEPC-H2O溶解。取2.0 μl RNA样品，紫外分光光度计A260 波长下测得RNA浓度，置-80℃保存。使用Fermentas逆转录试剂盒按照说明进行逆转录。 TLR-4 引物，Forward primer （5′-3′）：5'-GAC CTG TCC CTG AAC CCT A-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-AAA TGT TGC CAT CCG AAA-3'； 扩增产物 380 bp。TLR-2 引物，Forward primer（5′-3′）：5'-GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-CTG AGC CTC GTC CAT GGG CCA CTC C-3'；扩增产物 639 bp。 β-actin引物，Forward primer（5′-3′）：5'-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3'；Reverse primer（5′-3′）：5'-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3'；扩增产物为 592 bp。72℃，7 min，RT-PCR 32个循环。PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳和电泳条带分析：Labwork凝胶成像系统紫外光下成像分析，并应用附带软件分析目标条带与内参β-actin条带吸光度值之比，进行半定量分析。②取EDTA抗凝血4 ml加入等体积的PBS液稀释并混匀，将稀释的血液8 ml加入含有4 ml淋巴细胞分离液的15 ml离心管中，室温下离心2 000 r/min，20 min。吸取交界处PBMC层并移入另一个15 ml离心管中；加入8 ml PBS混悬细胞；室温下离心2 000 r/min。20 min，弃上清；用8 ml PBS再次混悬细胞，室温下离心2 000 r/min，20 min，弃上清；用含10%胎牛血清的1640 培养液稀释混悬细胞，分配至24 孔培养板，一份标本转入两孔，使浓度为1 ×106/孔，总体积为2 ml/孔，一孔用阿托伐他汀（终浓度为0.01 mmol/L）刺激，自身对照孔不予用药，均在37℃CO2恒温孵育箱为中连续培养细胞24 h后，无菌EP管收集，离心后弃上清，留取细胞。用PBS洗涤细胞2次，提取细胞总RNA，进行逆转录合成cDNA及PCR扩增（同上）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0 进行数据处理分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周单个核细胞TLR-2 和TLR-4 表达水平对比

①与健康志愿者组比较，AS患者组TLR-2 mRNA表达增高（图1）。健康志愿者组TLR-2 mRNA表达水平为（0.06 ±0.39），AS 患者组 TLR-2 mRNA 表达水平为 （1.59 ±1.43），AS患者组与健康志愿者组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。②与健康志愿者组比较，AS患者组TLR-4 mRNA表达增高（图2）。 健康志愿者组TLR-4 mRNA表达水平为 （0.06 ±0.39），AS 患者组 TLR-4 mRNA 表达水平为 （0.60 ±0.73），AS患者组与健康志愿者组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 TLR-2 mRNA表达（1、2 为健康志愿者；3、4 为患者）

图2 TLR-4 mRNA 表达（1、2 为健康志愿者；3、4、5 为患者）

2.2 阿托伐他汀干预对AS患者外周单个核细胞TLR-2 和TLR-4 表达水平的影响

①RT-PCR分析显示，与空白对照组比较，阿托伐他汀干预组TLR-2 mRNA表达下降 （图3）。阿托伐他汀干预组（0.59 ±0.44）和空白对照组（1.71 ±1.70）TLR-2 mRNA 比较，差异有统计学意义（P=0.02<0.05）。②与空白对照组比较，阿托伐他汀干预组TLR-4 mRNA表达下降（图4）。阿托伐他汀干预组（0.25 ±0.25）和空白对照组（0.96 ±1.04）TLR-4 mRNA 比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 干预后TLR-2 mRNA表达（1 为对照组，2 为干预组）

图4 干预后TLR-4 mRNA表达（1 为对照组，2 为干预组）

3 讨论

强直性脊柱炎的发病原因迄今未明，一般认为是遗传因素和环境因素相互作用所致，目前很多学者将强直性脊柱炎划归为自身免疫性疾病，其发病与患者自身的免疫失调有密切关系，患者往往存在免疫球蛋白、C反应蛋白的显著变化，除了确诊标志 HLA-B27 外，B7，B22，B40，BW42 等与 AS 也密切相关。Toll样受体位于细胞膜上，是一种膜蛋白，在抵抗病原体的入侵，即在天然免疫中发挥重要作用，目前已知参与天然免疫的主要是TLR-2 和TLR-4。当病原体及其产物与病原体的识别受体结合后，细胞即活化并释放大量细胞因子或炎症递质，参与天然和获得性免疫的炎症反应[6]。TLR-4被活化后通过NF-κB途径向细胞内传递信号，可能由被修饰的脂蛋白引起[7]，脂蛋白可上调TLR-4 的表达[8]。本研究发现TLR-2 和TLR-4 与AS有密切的关系，AS患者外周血单个核细胞表达水平显著高于健康志愿者，提示TLR-2 和TLR-4可能参与AS的发病。

他汀类药物，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，被广泛应用于降低胆固醇和脂质调节，但最近的研究表明，他汀类药物有潜在的抗炎及调节免疫作用。Van Wissen等[9]报道大样本试验证实他汀类可降低C反应蛋白的水平。他汀类药物可以阻止巨噬细胞趋化因子的释放，延缓趋化反应和氧化反应，降低NK细胞的体外细胞毒性，抑制抗中性粒细胞胞浆抗体诱导的中性粒细胞的体外激活，这些效应提示天然免疫反应易受HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制[10]。Leung等[11]最近的研究显示，辛伐他汀在体外能抑制滑膜T细胞和成纤维样滑膜细胞释放细胞因子。Methe等[12]实验表明他汀可以下调由LPS刺激引起的TLR-4 的升高及其下游信号。他汀类药物可以抑制核因子κB的表达和活性，从而影响趋化因子、黏附分子、血管壁中单核细胞趋化蛋白-1和其他炎症相关蛋白的表达。他汀类药物有调节免疫应答的作用，包括作用于各种免疫细胞（主要是单核巨噬细胞和T细胞）的聚集、分化、增殖、分泌活动。这些都表明他汀类药物有非依赖降脂免疫调节的作用。这些发现为指示他汀类药物可能作为一种新的免疫抑制剂提供了肯定的科学理论，本实验显示阿托伐他汀可以抑制天然免疫的重要分子TLR-2、TLR-4 的表达，意味着阿托伐他汀可能作为免疫调节剂应用于AS的治疗。

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