降浊颗粒对慢性肾衰竭大鼠肾组织纤维连接蛋白的影响

吉 勤 李 潇 谢江海 杨文荣 谷 艳

1.云南中医学院第一附属医院肾病科，云南昆明 650021；2.云南中医学院临床医学院西医诊断教研室，云南昆明 650500

慢性肾功能衰竭（CRF）是各种原发或继发性肾脏病终末期的共同表现，据国际肾脏病协会统计，本症自然人群发病率为98～198/百万人口，我国的统计资料显示尿毒症的年发病率为100～130/百万人口[1]，且有逐年增多的趋势。尽管分子生物学、免疫学飞速发展，对CRF的发病机制有了深入的认识，但是对于CRF的治疗，目前除替代疗法和肾脏移植，尚无其他满意的治疗方法。深入开展CRF的防治研究，延缓肾脏病的进展，减少CRF的发生具有重要的现实和经济意义。中医的辨证论治有着多靶点、综合治疗的效果，探讨中医药治疗CRF的有效药方已越来越受到重视。

“降浊颗粒”（由陈皮、茯苓、党参、半夏、生姜、大黄等组成）针对CRF患者胃肠机能紊乱这个环节而设，以健脾和胃、理气化湿、降浊止呕为主，经过长期临床验证降浊颗粒能明显改善CRF患者的胃肠道症状[2]，还发现该药对降低 CRF 患者血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血磷，升高血钙也起到了一定的作用。降浊颗粒在改善CRF患者的生存质量、延缓CRF进程、延缓透析时间、使患者带病延年等方面具有重要的现实意义[3-5]。本研究通过观察降浊颗粒对CRF大鼠肾组织纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的影响，观察降浊颗粒对CRF的治疗作用及抗肾间质纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

BM-IX生物组织包埋机 （孝感市宏业医用仪器有限公司），台式干燥箱202-0 型（北京市永光明医疗器械厂），LEICA RM2235 切片机，CS-IV摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司）。

1.2 实验动物

Wistar雄性大鼠120只，清洁级 [动物合格证号：SCXK（川）2010-15]，体重（200 ±20） g，6～8 周龄。

1.3 实验药物

降浊颗粒（15 g/袋；批号：20100501；云南理想药业有限公司生产），洛丁新 （盐酸贝那普利；10 mg/片；国药准字H20030514；批号：008000；北京诺华制药有限公司），FN小鼠单克隆抗体[Abcam；FN（ab6328）]，超敏 SP（鼠/兔）试剂盒（KIT-9730）（迈新生物技术公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的制作 选择健康Wistar雄性大鼠120只，随机分为假手术组及模型组，5/6 肾大部切除法 （两期手术）建立CFR大鼠模型。

Ⅰ期手术：10%水合氯醛0.3 mL/100 g（体重）腹腔麻醉，背左侧12 肋下脊柱旁竖切口，充分剥离左肾包膜，迅速切除上、下1/3 肾组织，以明胶海绵压迫切面止血，然后分层缝合。术后10 d行Ⅱ期手术，同样的方法麻醉，右侧背部切开暴露右肾，结扎肾蒂，摘除右肾。假手术组与模型组同期行2次手术，但只打开腹腔，剥离肾包膜后缝合腹腔。全部动物自由摄取普通饲料和饮水。

Ⅱ期术后大鼠喂养7周后，随机抽出假手术组2只、模型组大鼠10只处死，取残余肾作病理HE染色，观察肾小球、肾小管、肾间质变化，见图1；所有大鼠尾部采血，测血BUN、Scr；确定CRF模型造模成功。造模期间大鼠死亡18只。

1.4.2 动物分组 模型组大鼠随机分为五组：模型对照组、贝那普利组、降浊颗粒高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组，每组各15只；加假手术组（15只）共六组大鼠。

1.4.3 给药方法 降浊颗粒为临床经验方，60 kg人用剂量为45 g/d。大鼠给药剂量根据人与动物体表面积折算公式：理论上大鼠等效量=45 g×0.018 ×5=4.05 g，即理论上大鼠给予降浊颗粒有效剂量为4.05 g/（kg·d），降浊颗粒低剂量组为临床等效组，降浊颗粒中剂量组给药剂量为等效剂量的2 倍，即8.1 g/（kg·d），降浊颗粒高剂量组给药剂量为等效剂量的4 倍，即 16.2 g/（kg·d）。

①假手术组（正常对照组）：予生理盐水2 mL/d灌胃；②模型对照组：予生理盐水2 mL/d灌胃；③贝那普利组：予2 mL/d（1.2 mg/d）贝那普利悬液灌胃；④降浊颗粒低剂量治疗组：予降浊颗粒4.0 g/（kg·d）灌胃；⑤降浊颗粒中剂量治疗组：予降浊颗粒8.1g/（kg·d）灌胃；⑥降浊颗粒高剂量治疗组：予降浊颗粒16.2g/（kg·d）灌胃。 六组动物连续给药 60 d，全部动物自由摄取普通饲料和饮水。

1.4.4 检测内容及方法 ①一般状态：精神状态、摄食、活动、体毛、尿量、体重及生存率；②血清Scr、BUN；③FN免疫组织化学染色（SP法）技术分析：采用免疫组化SP法检测肾小管-间质FN，第一抗体采用FN小鼠单克隆抗体，第二抗体采用超敏SP（鼠/兔）试剂盒，DAB显色。

1.5 结果判定

阳性：细胞胞浆或细胞膜出现棕黄色染色。按以下分析：①按平均灰度评分：平均灰度灰度数值从256 到0，256 到0 代表从白到黑。平均灰度数值越小，表示染色越深，表达量越多。②按阳性细胞率评分：按染色阳性细胞占每个视野范围评分：3分：＞相应视野50%；2分：占相应视野25%～50%；1分：＜相应视野25%；0分：无。每张切片低倍镜下依序单盲观察5个视野，计算各项计分之和。

1.6 统计学方法

实验结果采用SPSS 13.0 for Windows统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模后模型组大鼠与假手术组比较，进食量少，精神差，反应迟钝，活动减少，体重减轻，肢尾湿冷，鼠毛无光泽且有耸毛现象。贝那普利组和降浊颗粒各组经过治疗后，大鼠进食有所恢复，鼠毛较模型组润泽、光亮，活动有所增多，体重有所增加。

给药期间大鼠死亡情况：假手术组无死亡，贝那普利组死亡1只，模型对照组死亡3只，降浊颗粒低剂量组死亡2只，降浊颗粒中剂量组死亡2只，降浊颗粒高剂量组死亡1只。各组动物死亡率无明显差异。

2.2 血生化检查

经治疗后，贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组血清BUN、Scr水平明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），降浊颗粒高、中、低剂量组与贝那普利组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 降浊颗粒对5/6肾切除CRF大鼠BUN、Scr的影响（±s）

表1 降浊颗粒对5/6肾切除CRF大鼠BUN、Scr的影响（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与贝那普利组比较，#P＜0.05

组别只数 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）假手术组模型对照组贝那普利组降浊颗粒高剂量组降浊颗粒中剂量组降浊颗粒低剂量组15 12 14 14 13 13 5.82 ±0.71△#15.67 ±1.02**#10.04 ±1.25**△9.82 ±1.41**△9.98 ±1.52**△10.56 ±1.17**105.40 ±6.97△#137.80 ±9.10**#122.61 ±5.59**△119.35 ±5.87**△124.50 ±5.71**△129.69 ±5.52**△

2.3 降浊颗粒对5/6 肾切除大鼠FN阳性细胞率及平均灰度的影响

经治疗后，贝那普利组，降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；降浊颗粒高、中剂量组，贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。降浊颗粒高、中剂量组FN表达与贝那普利组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1、图2。

表1 降浊颗粒对5/6肾切除大鼠FN阳性细胞率及平均灰度的影响（±s）

表1 降浊颗粒对5/6肾切除大鼠FN阳性细胞率及平均灰度的影响（±s）

注：与假手术组比较，#P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.01；与贝那普利组比较，△P＜0.05

组别只数 FN阳性细胞率 FN平均灰度假手术组模型对照组贝那普利组降浊颗粒高剂量组降浊颗粒中剂量组降浊颗粒低剂量组15 12 14 14 13 13 1.20 ±1.35 6.50 ±1.75#△0.86 ±1.03*0.92 ±1.20*1.57 ±2.07*3.50 ±1.71#*△175.73 ±46.03 109.38 ±22.18#△180.55 ±40.13*184.17 ±41.71*184.57 ±46.20*138.50 ±36.24#△

3 讨论

肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病慢性进展，最终导致肾功能衰竭的共同机制，而细胞外基质（ECM）的过度积聚是导致肾纤维化的最主要因素之一。研究证实，ECM合成和降解失衡是ECM聚集及肾小球功能损伤的主要原因[6]。ECM主要是由LN、FN、ColⅢ等成分组成。

FN是细胞外基质中一类重要的糖蛋白，主要位于小管间质区，彼此以纤维结构相连，对肾小管正常结构起着重要作用，正常情况下，FN在肾脏表达不明显，在肾间质病变时表达增强，进一步的研究又发现其变化与总的细胞外基质的变化趋势相一致，在炎症条件下，对介导细胞增殖和其他细胞外基质成分的沉积具有重要意义[7]。

在本研究中，模型对照组与假手术组比较FN表达增加，符合慢性肾衰竭病理改变。经治疗后，贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组，降浊颗粒高、中剂量组和贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高；降浊颗粒高、中剂量组降低FN表达疗效与贝那普利组相当。说明降浊颗粒能减少CRF大鼠肾组织FN的表达，干预肾间质纤维化，延缓大鼠CRF进展，尤其以高、中剂量组疗效最佳，其疗效与贝那普利相当。

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