巴戟天醇提物对离体大鼠缺血再灌注损伤心肌能量代谢的影响

刘灵芝

郑州人民医院心血管内科，河南郑州 450003

心缺血再灌注损伤 （ischemia-reperfusion injury，IRI）是指心肌较长时间缺血造成一定损伤后，恢复血供，不但不能减轻或逆转损伤，反而加重损伤的一种病理生理现象，常见于临床上急性心肌梗死及缺血性心脏病的治疗过程中，主要形成机制包括心肌细胞能量代谢障碍、钙超载、自由基损伤、线粒体功能损伤及心肌细胞凋亡等[1]。巴戟天属于茜草科植物，肉质根可以入药，具有补肾壮阳之功效。以往的研究表明，巴戟天醇提物具有减轻心肌IRI的作用，且这种作用可能与其能够减轻IRI心肌细胞脂质过氧化及细胞凋亡有关[2]。近年来，随着心肌IRI机制的研究进展，有学者发现能量代谢的改变在心肌IRI形成过程可能发挥一定的作用，但巴戟天醇提物对IRI心肌能量代谢的影响尚未见报道。因此，笔者利用Langendorff灌流装置制备离体大鼠心脏IRI模型，探讨巴戟天醇提物对大鼠IRI心肌能量代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 巴戟天购自广东省德庆县药材公司，一等品，由河南省食品药品检验所鉴定，由所购生药提取得到巴戟天醇提物；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）及一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）3 种物质的钠盐均购自 Amresco公司，批号分别为0614、0340、0712；其他试剂均为国内分析纯。

1.1.2 仪器 Langendorff灌流装置（上海奥尔科特生物科技有限公司）；高效液相色谱仪（SPD-10A紫外检测器、CLASS-VP色谱工作站）（日本岛津公司）；Scienhome C18色谱柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）（天津市琛航科技仪器有限公司）。

1.1.3 实验对象 健康雄性Wistar大鼠，体质量265～295 g，平均（278 ±16）g，购自河南省实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 离体心脏灌流模型的建立 大鼠采取腹腔注射质量分数2%戊巴比妥钠（0.2 μL/g）进行麻醉，同时注射质量分数2%肝素钠（0.1 μL/g）抗凝；开胸取出心脏，置入盛有 0～4℃预冷灌流液的器皿中，用灌流液冲洗后，于Langendorff灌流装置上开始进行灌流。灌流压：82 kPa，用Krebs-Hanseleit磷酸缓冲液作为灌流液。其成分（mmol/L）如下：NaCl 118，NaHCO325.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl222.5，Glucose 11.0，pH为7.4，渗透压达到了300 mOsm/L；灌流前用体积分数95%O2+5%CO2混合气体平衡15 min，灌流过程中保持，保持装置内温度处于37℃，并持续通气。

1.2.2 分组及处理 40只Wistar大鼠随机分为空白对照组、IRI组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组四组，每组10只大鼠。空白对照组：持续灌流110 min；IRI组：预灌20 min，保持37℃条件下，停灌60 min，再复灌30 min；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组：分别在预灌时加入浓度为600、300 mg/L巴戟天醇提物，其他处理同IRI组。

1.2.3 高能磷酸化合物的测定 灌流结束后，每只大鼠心脏立即剪取左心室100 mg，采用0.42 mol/L预冷高氯酸制成匀浆，采用1.00 mol/L氢氧化钾进行中和，采用超声波细胞粉碎器粉碎线粒体膜（在冰水中进行）。4℃情况下，以10 000 r/min的速度离心10 min；吸取20 μL上清液采用高相液相色谱仪测定各种高能磷酸化合物含量，色谱条件：由215 mmol/L的KH2PO4和3.5%乙腈组成流动相，然后用三乙胺调节pH值至6.1，流速控制在0.5mL/min，柱温30℃，检测波长为210nm。得到ATP、ADP、AMP检测结果后计算心肌总腺嘌呤核苷酸含量 （total adenine nucleotides，TAN）及心肌细胞能荷（energy charge，EC）， 其 中 TAN=ATP+ADP+AMP，EC=（ATP+0.5 ×ADP）/TAN。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 13.0 进行统计学分析，TAP、ADP、AMP、TAN及EC等计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，并进行正态性检验和方差齐性检验，比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

IRI组的 ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC低于空白对照组，差异有统计学意义（均P<0.05）。与IRI组相比，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的TAP、ADP、AMP、TAN及EC升高，差异有统计学意义（均P<0.05）。巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的TAP、ADP、AMP、TAN及EC比较差异有统计学意义（均P<0.05）。 见表1。

3 讨论

心肌IRI是一个受多因素影响的复杂病理生理过程，其中能量代谢障碍、生物膜脂质过氧化、氧自由基的产生过多或清除障碍、心肌细胞凋亡等机制研究较为彻底[3-5]。

表1 离体大鼠心肌组织中高能磷酸化合物的含量（±s，n＝10）

表1 离体大鼠心肌组织中高能磷酸化合物的含量（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与IRI组比较，*P<0.05；与巴戟天高剂量组比较，※P<0.05

组别 ATP（mg/100 g） ADP （mg/100 g） AMP（mg/100 g） TAN（mg/100 g） EC空白对照组IRI组巴戟天高剂量组巴戟天低剂量组F值P值25.26 ±4.27 7.98 ±1.49△15.94 ±2.73*12.49 ±2.54*※62.982<0.01 82.39 ±5.90 14.33 ±2.95△42.38 ±4.55*23.57 ±4.48*※419.460<0.01 78.33 ±9.14 39.34 ±3.03△60.03 ±8.34*53.24 ±5.67*※49.073<0.01 185.98 ±10.53 61.65 ±3.29△118.35 ±10.17*89.30 ±5.60*※448.490<0.01 0.36 ±0.03 0.25 ±0.02△0.31 ±0.04*0.28 ±0.03*※25.450<0.01

近年来，有学者[6-7]提出能量代谢障碍是心肌IRI的始动因子，ATP的正常合成和保存在保护心肌结构和功能完整中起着重要作用，而且心肌细胞发挥正常功能离不开ATP提供的能量。当心肌发生缺血时，心肌细胞获取能量的途径由有氧代谢变为无氧糖酵解，然而两者产生ATP的效力差异较大，后者仅为前者的1/18，这一变化造成了心肌细胞内ATP含量急速下降，根本无法满足心肌细胞正常生存的基本需要，最终这些变化造成心肌细胞能量代谢障碍及心肌组织结构和功能的丧失，同时ATP含量的下降还影响细胞膜上依靠ATP的泵的功能，进而导致心肌细胞钙超载和氧自由基产生过多[6-8]。ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC 是心肌能量代谢研究领域的重要观察指标，这些指标的变化能够直观反映心肌细胞的能量代谢情况，例如ATP的含量不仅可以反映线粒体的氧化呼吸火星和合成高能磷酸化合物的能力，而且还可以反映心肌细胞的能量存储状况；EC也是反映心肌能量代谢的重要指标，其与线粒体氧化磷酸化功能和能量代谢状况关系密切，EC的降低说明可利用高能磷酸化合物含量减少[9]。另外，ATP合成不能够满足需求时，心肌细胞所需能量主要来源于ATP按照ATP、ADP、AMP、腺苷、次黄嘌呤的顺序降解，然而这也进一步加重了各种能量物质及其总量的减少，还有EC的降低。

本研究结果显示：IRI组的心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN及EC均低于空白对照组，提示心肌能量代谢障碍可能作为心肌发生IRI的病理生理基础；巴戟天醇提物两个剂量组的 ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC 高于 IRI组，提示巴戟天醇提物具有改善心肌细胞能量代谢的作用，这可能与其能够保护线粒体的氧化呼吸活性，增强线粒体氧化磷酸化功能和生成高能磷酸化合物的能力，使心肌细胞可利用高能磷酸化合物含量增加等有关[8]。

综上所述，巴戟天醇提物能够改善IRI心肌的能量代谢，但其影响能量代谢的具体机制尚不明确，尚需进一步深入研究证实，另外，由于能量代谢障碍是心肌IRI的始动因子，所以巴戟天醇提物可能通过该途径发挥保护IRI心肌的作用。

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