红藤消炎灌肠液微生物限度检查方法的验证试验

● 王伟东

红藤消炎灌肠液具清热解毒，活血化瘀功效，临床用于附件炎、盆腔炎。其成分为大血藤、野菊花、蒲公英、地丁、败酱草、三棱、莪术(醋制)、桃仁、延胡索(醋制)、香附(醋制)、木香等11味中药，因处方中多味药有抗菌、消炎的作用，对试验菌采用常规方法做微生物限度检查时，对阳性试验菌干扰，阳性试验菌的回收率达不到药典要求的不低于70%。我们采用薄膜过滤法［1］，按中国药典2010年版二部相关规定［2］进行试验，结果表明，该法省时、易操作，适用于红藤消炎灌肠液微生物限度检查。

1 材料

1.1 仪器 净化工作台(szk－202安徽省蚌埠净化设备有限公司)、隔水式恒温培养箱(PYX_DHS－40*50上海市跃进医疗器械厂)、立式灭菌器(3260J山东新华医疗器械有限公司)、薄膜过滤器(杭州泰林生物技术有限公司)、集菌仪(H601杭州高得医疗器械有限公司)。

1.2 培养基 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁氏液体培养基、改良马丁氏琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲胺琼脂培养基，均由北京陆桥技术有限公司生产。

1.3 稀释剂 氯化钠－蛋白胨缓冲液，北京陆桥技术有限公司生产。

1.4 菌种 大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］由中国药品生物制品检定所提供，所有菌种均为第4代。

1.5 样品 红藤消炎灌肠液(500ml/瓶)，黄石市中医院制剂室提供。

2 方法

2.1 细菌数、霉菌和酵母菌数检查方法的验证

2.1.1 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，取上述新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液，稀释至活菌数50～100cfu·ml－1，备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁氏液体培养基中，25℃培养18～24h，取上述新鲜培养物 1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液，稀释至活菌数50～100cfu·ml－1，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁氏琼脂斜面培养基中，25℃培养1周，加5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用标准比浊管比浊，取上述新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液，稀释至活菌数50 ～100cfu·ml－1，备用。

2.1.2 供试液制备 吸取样品10ml至有无菌玻璃珠的250ml三角烧瓶中，加90ml无菌的稀释液，混匀，使成1∶10的供试液。取上述供试液10ml(相当于样品1ml)，加入100ml无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用200ml的稀释剂冲洗，消除抑菌成分后，取出滤膜，菌面朝上，贴于规定的琼脂平板上培养。

2.1.3 回收率测定

(1)试验组:分别取1∶10的供试液10ml(相当于样品1ml)，各加入100ml无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400ml的稀释剂冲洗，预留100ml稀释剂各加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml(50～100cfu·ml－1)，按薄膜过滤法，取出滤膜，菌面朝上，贴于规定的琼脂平板上，置规定温度培养24～72h，逐目观察结果。

(2)菌液组:除不加供试液外，其余操作同试验组。

(3)供试品对照组:除不加菌悬液外，其余操作同试验组。

(4)稀释剂对照组:用稀释液取代供试液，其余操作同试验组。

2.1.4 回收率计算 验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

(1)试验组的菌回收率=

(2)稀释剂对照组的菌回收率=

2.2 控制菌检查方法的验证

2.2.1 试验组 分别取1∶10的供试液10ml(相当于样品1ml)，各加入100ml无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400ml的稀释剂冲洗，预留100ml稀释剂，分别加入金黄色葡萄球菌液1ml(50～100cfu·ml－1)、铜绿假单胞菌液1ml(50～100cfu·ml－1)，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，分别贴于甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲胺琼脂培养基中35℃培养24h。

2.2.2 阴性对照组:用稀释剂10ml，替代供试液及验证菌液，按试验组进行检查和培养。

2.2.3 阳性对照组:除不加供试液外，其余操作同试验组。

3 结果

3.1 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的验证结果 回收率见表1，该试验对5种菌种的回收率均高于70%。

表1 薄膜过滤法菌落计数及回收率测定

3.2 控制菌检查方法的验证结果 试验组检出金黄色葡萄球、铜绿假单胞菌;阳性对照组检出金黄色葡萄球、铜绿假单胞菌;阴性对照组无菌生长。该方法能检出金黄色葡萄球、铜绿假单胞菌，适合于该制剂的控制菌检查。

4 讨论

药品的微生物限度检查结果受许多因素的影响，在进行微生物检测时，只有在该检测条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长，才能使供试品中污染的微生物得以真实反映。因此，药品的微生物限度检查应通过验证试验证明所采用的方法是适宜的，方可使用［3］。中药制剂多为含有多种成分的复方制剂，同时生产中使用含抑菌作用的辅料以及加入抑菌剂或防腐剂等原因，影响微生物检查结果的因素更多，必须采取合适的试验方法去除制剂的抑菌作用，才能真实反映制剂受污染的程度［4］。

通常，对无抑菌作用的制剂可用常规法进行微生物限度检查，对抑菌作用较弱的制剂可通过稀释培养基来消除其抑菌作用。本文作者实际工作中对红藤消炎灌肠液进行微生物限度检查时，发现该制剂具有很强的抑菌活性，不能直接采用常规法或稀释培养基法。本文采用薄膜过滤法，去除其抑菌活性成分，进行验证试验。为保证试验的科学性和准确性，本试验严格按照《中国药典》规定，选择5种菌株进行验证，结果表明，采用薄膜过滤法可有效消除红藤消炎灌肠液抑菌作用，各菌回收率均＞70% ，同时控制菌的检查方法能有效检出控制菌，该方法适合红藤消炎灌肠液的微生物限度检查。

［1］马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册［M］.北京:科学出版社.

［2］国家药典委员会.中国药典2010年版(二部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录 XIJ，107.

［3］曹雄伟.最新药品微生物检验方法与操作标准规范及无菌隔离技术实用手册.上卷［S］.北京:中国中医药出版社，2009:261.

［4］陈华龙，王莉蓓，谭莉萍.姜胆咳喘片微生物限度检查方法的验证［J］.中国实验方剂学杂志，2010，(11):67.