一种新型凝固剂在固体平板分离极端浸矿菌中应用潜力研究

夏金兰，潘佳民，巩三强，金雪洁，聂珍媛，闫艺赢，邱冠周

（1. 中南大学资源加工与生物工程学院，湖南 长沙 410083； 2. 生物冶金教育部重点实验室，湖南 长沙 410083）

一种新型凝固剂在固体平板分离极端浸矿菌中应用潜力研究

夏金兰1,2，潘佳民1，巩三强1，金雪洁1，聂珍媛1，闫艺赢1，邱冠周1,2

（1. 中南大学资源加工与生物工程学院，湖南 长沙 410083； 2. 生物冶金教育部重点实验室，湖南 长沙 410083）

利用一种新型、耐高温、耐酸的基质作凝固剂，设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的固体平板培养基。在此基础上，结合水盘培养法，成功的实现了高温嗜热浸矿菌、中等嗜热浸矿菌以及嗜中温浸矿菌的固体平板培养及纯化。待试验的三种极端浸矿菌：高温嗜热浸矿菌万座酸菌（Acidianus manzaensis）、中等嗜热浸矿菌 (Ferroplasma thermophilum L1)、嗜中温浸矿菌(来自实际矿山酸性矿坑水)都能在此固体培养基表面形成圆形粘液状米黄色菌落；菌落扫描电镜结果表明：菌落内部结合较为松散，单个细菌通过胞外附属结构或物质与培养基基质紧密结合。实验结果表明该固体培养基在浸矿菌分离纯化、菌种鉴定、以及遗传改良等方面具有广阔的应用前景。

凝固剂; 固体培养基; 浸矿微生物; 扫描电镜

近年来，金属硫化矿的生物浸出技术因其环境友好型以及低成本而成为矿冶技术的研究热点[1]。目前，生物浸出技术的研究几乎涉及整个硫化矿、铀矿、锰矿等。但有工业化应用的仅限于铜、金以及铀矿。铜、金矿生物浸出产业以初具工业化规模。生物浸出技术作为一项绿色矿产资源综合利用技术，具备广阔的应用潜力[2]。

但是，现阶段生物浸出技术浸出速率慢，是限制其大规模工业化应用的最主要因素。其关键是对浸矿微生物浸矿机理知之甚少以及现有的菌种资源氧化活力低下，其根本原因是没有很好的方法或固体培养基获得大量有特色的菌落以供菌株筛选、选育及遗传特性研究[3]。

近些年来，随着分子生物学技术和其他相关技术在微生物分离检测中的应用，越来越多的极端微生物被检测到，并且随着研究的深入和技术的进步，许多微生物从不可培养状态达到了可培养状态，对新分离纯化出的极端菌的性质的研究也取得了许多新进展。但是这些技术由于条件要求苛刻，操作繁琐，另外获得的纯培养物很难进行遗传操作，很难在实验室推广。因此，大多数研究者依然采用固体培养基分离纯化极端微生物。浸矿菌相对其他极端菌而言，固体纯培养更加困难，有的学者甚至认为浸矿菌不能实现固体纯培养。其难度有三方面:首先是固体培养基难以制作，原因是没有一种常用的固体凝固剂可适用于自养浸矿菌种；其次是培养基的能源问题，可供选择的种类太少，尤其是水溶性种类更少，非水溶性在固体培养基中易沉降，分布不均，而且这些种类化学性质多不稳定，易氧化、易分解，不能高温灭菌，如硫代硫酸钠、亚硫酸钠和硫酸亚铁；三是培养条件要求高，培养温度高，但生长缓慢，而且要求通氧性好，因此培养基易干燥。其中最难克服、研究最多的是凝固剂[4,5]。

Khalid A M等利用脱乙酞吉兰糖胶(Gelrite)做凝固剂[6]，由于该凝固剂可减免对浸矿自养菌的抑制作用，有较高的克隆率，而且转培养性能较好好，因此被认为是目前较理想的凝固剂。但是，到目前为止，国内仍然未完全解决浸矿自养菌固体纯培养问题，浸矿菌纯培养任然是限制理论与应用研究的“瓶颈”[7,8]。

本论文通过前期大量的探索，找到了一种新型、耐高温、耐酸的凝固剂[9],在此基础上，通过大量试验，设计了一种新型的分离纯化极端浸矿微生物的固体平板培养基及培养方法。利用该固体培养基及培养方法，成功的实现了高温嗜热浸矿菌万座酸菌（Acidianus manzaensis）、中等嗜热浸矿菌（Ferroplasma thermophilum L1）以及嗜中温浸矿菌(来自实际酸性矿坑水样品)的固体平板培养及纯化，首次获得浸矿菌在固体培养基表面的菌体形貌图。菌落以及菌落液体再培养物扫描电镜结果（见图2，图3）进一步证实了该方法的可靠性。结果表明：该培养基具有一定的普适性，在极端嗜热/嗜酸，中度嗜热嗜热/嗜酸及嗜中温浸矿细菌的分离纯化、改良、浸矿机理等研究方面具有广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

菌种：高温嗜热浸矿菌万座酸菌（Acidianus manzaensis），最适生长温度65 ℃,最适pH=1.5（以亚铁为能源）。中等嗜热浸矿菌 (Ferroplasma thermophilum L1)，最适生长温度 45 ℃，最适pH=1.0。菌种由教育部生物冶金重点实验室提供,嗜中温浸矿菌(来自实际矿山酸性矿坑水)。

基础培养基：（9K培养基)3 g/L (NH4)2SO4，0.1 g/L KCl，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L Ca(NO3)2，0.1 g/L 酵母浸出液。（所有药品均为分析级，购自天津大茂)。

凝固剂：一种新型、耐高温、耐酸凝固剂[9]。

仪器与设备：高温油浴摇床（SHA-GW），隔水式恒温培养箱（上海一恒-9050），酸度计（SARTORIUS PB-10），自制水盘,扫描电镜（SEM，JEOLJSM6360 LV）。

1.2 凝固剂相关参数的测定

按照表1设计单因素试验，初步确定凝固剂凝固条件。

表1 凝固剂相关参数的确定（凝固剂含量、pH、钝化温度对凝固剂凝固的影响）Table 1 Determine of coagulator parameters ( Effect of coagulator content, pH and deactivation temperature on the solidification of coagulator )

1.3 培养基的制作及最佳菌落形成条件的确定

按照下述过程制作固体培养基，按照表2优化菌落形成条件。

A液：600 mL蒸馏水，调pH值，加入凝固剂（培养基成分优化见表2）。

B液：9 K营养盐液350 mL，调pH值、添加硫氰酸钾、酵母浸出液。

C液：50 mL 9 K营养盐液中加入一定量的硫酸亚铁，待其全部溶解后，采用0.22 µm滤膜过滤除菌。

（A、B液121 ℃灭菌20 min，冷却至80 ℃左右，A、B、C液纱布过滤混合，倒制平板（9 cm)，每板大约25 mL。）

表2 菌落最佳形成条件的优化Table 2 Optimizing conditions for colony formation

1.4 极端浸矿菌平板培养及纯化方法

1.4.1 菌种活化

高温嗜热浸矿菌万座酸菌（Acidianus manzaensis）、 中 等 嗜 热 浸 矿 菌 (Ferroplasma thermophilum L1)，在以 FeSO4·7H2O（22.2 g/L)为能源基质的9 K培养基中进行培养活化，采用血小板计数器计数，待其进入对数生长期，转接，如此重复3次。

1.4.2 系列稀释及涂布平板

取对数期的菌种，系列稀释，分别吸取 1 mL 10-2、10-3稀释液于固体培养基中，涂布平板。嗜中温菌 (来自实际矿山酸性矿坑水) 直接吸取 1 mL，涂布平板（设置3个平行，1组空白对照）。

1.4.3 培养方法

平板倒置均匀放入自制水盘，高温嗜热浸矿菌万座酸菌（Acidianus manzaensis）于65 ℃培养，中等嗜热浸矿菌 (Ferroplasma thermophilum L1) 于52℃培养。每隔24 h，向自制水盘中添加1次水，保持水盘湿度。嗜中温菌于37 ℃培养。观察，照片，统计菌落生长情况。

1.4.4 细菌再培养获得纯培养

小心挑取单菌落于液体9 K培养基中进行培养(以 FeSO4·7H2O为能源（22.2 g/L)），重复以上步骤，镜捡，最终获得纯培养。

2 结果与分析

2.1 凝固剂相关凝固参数

通过初步试验，确定凝固剂在水作为溶剂的条件下的凝固参数为：凝固剂含量>21 g/L、2.090 ℃。

2.2 培养基的制作及最佳菌落形成条件

综合考虑到浸矿菌生长的环境条件及实验室保藏的菌种的最佳生长条件，并参考丁建南，张在海等[6,7]浸矿微生物分离纯化方法,设计培养基的配制方法、初始pH以及营养盐和硫氰酸钾的大致范围。

2.2.1 A、B、C液组合方式对培养基凝固性的影响见表3。

表3 A、B、C液组合方式对培养基凝固性的影响Table3 Effect of combination of A,B,C liquid on the solidification of coagulator

2.2.2硫氰酸钾添加量对培养基凝固效果和菌落形成的影响

采用C组合方式，硫氰酸钾添加量设置5个浓度梯度，其它成分不变，考察硫氰酸钾对菌落形成的影响。实验结果见表4。

表4 硫氰酸钾添加量对培养基凝固效果和菌落形成的影响Table 4 Effect of additive amount of potassium rhodanide on the solidification of coagulator and colony formation

表4结果表明：在一定浓度范围之类，硫氰酸钾对菌落的形成具有促进作用。硫氰酸钾添加量为6 g/L时，浸矿菌在培养基表面能形成黄色较大的菌落。硫氰酸钾含量过高时，菌落小且成分散状，难以形成固着的较大菌落。可能由于固体培养基限制了传质速率，导致亚铁的快速氧化和铁帆的迅速产生，近一步引起培养基局部pH急剧变化，而不利于细菌菌落的形成，加入一定量的硫氰酸钾，硫氰酸钾可能与 Fe3+形成络合物，充当缓冲剂的角色，另一方面，也可以减轻 Fe3+对亚铁氧化酶的竞争性抑制，从而有利于菌落的形成。而加入过量的硫氰酸钾，可能K+对细菌具有一定的抑制作用，反而不利于菌落的形成。

2.2.3 硫酸亚铁添加量对培养基形态和菌落形成的影响

采用 C组合方式，硫酸亚铁添加量设置五个梯度，其它成分不变，硫氰酸钾添加量为6 g/L，考察能源底物硫酸亚铁对菌落形成的影响。实验结果见表5。

表5 硫酸亚铁添加量对培养基形态和菌落形成的影响Table 5 Effect of additive amount of ferrisulphas on culture medium form and colony formation

表5结果表明：硫酸亚铁含量为10 g/L时菌落较大，且数目较多，硫酸亚铁含量较高或低都不利于菌落的产生。可能由于，亚铁浓度过低时，细菌氧化性降低，繁殖速度下降，亚铁浓度过高时，细菌氧化速率增强，引起细菌接种的局部区域pH 急剧上升，同时Fe3+大幅度增加，所后导致铁帆大量产酸，使pH急剧下降，而不利于细菌菌落的形成。2.2.4 培养方式对培养基形态和菌落形成的影响

采用C组合方式，其它成分不变，硫氰酸钾添加量为6 g/L，硫酸亚铁添加量为10 g/L。探索培养方式对菌落形成的影响。实验结果见表6。

表6 培养方法对培养基形态和菌落形成的影响Table 6 Effect of culture methods on culture medium form and colony formation

表6结果表明：自制水盘能很好的保持培养基内水分，进而促使菌落的形成。

2.3 细菌再培养获得纯培养

挑取单菌落，进行液体再培养，重复以上步骤，反复镜检，直至获得纯培养。细菌再培养实验及扫描电镜结果表明：单菌落经过多代再培养后能在合成培养基上形成黄色纯菌落（见图1(a)），菌落直径>2 mm。浸矿菌与培养基基质通过细胞外附属结构或物质紧密吸附、整个菌落呈现圆形米黄色粘液状(见图2(e))。

2.4 固体培养基及培养方法普适性研究

中等嗜热浸矿菌 (Ferroplasma thermophilum L1)培养温度为52 ℃，嗜中温浸矿菌培养温度为37 ℃，其它培养基制作与培养条件与嗜高温浸矿菌一致。通过培养发现中等嗜热浸矿菌 (Ferroplasma thermophilum L1)、嗜中温浸矿菌都能在固体平板表面形成与嗜高温浸矿菌性质相似的菌落（见图1(b)、(c)）。

图2 浸矿菌在固体培养基表面单个菌体扫描电镜图Fig.2 Single colony scanning electron micrographs of bioleaching bacteria on the solid media surface

图3 浸矿菌液体培养物电镜图片Fig.3 Liquid medium electron micrographs of bioleaching bacteria

3 结 论

（1）采用一种新型耐高温、低酸凝固剂，设计了一种新型的分离纯化极端浸矿微生物的固体平板培养基。优化后培养基配方及制作方法如下：

A液：600 mL蒸馏水，调pH=2.5，加入凝固剂21 g/L。

B液：9K营养盐液350 mL，调pH=1.8，添加硫氰酸钾6 g/L。

C液：硫酸亚铁10 g，加入 50 mL 9K（pH=1.8）营养盐液，0.22 µm滤膜过滤除菌。

A、B液121 ℃灭菌20 min，冷却至80 ℃左右，A、B、C液纱布过滤混合均化，倒制平板（9 cm)，每板大约25 mL。

（2）利用该培养基，结合水盘培养法及微生物分离纯化技术，通过培养获得高温嗜热浸矿菌、中等嗜热浸矿菌以及嗜中温浸矿菌的固体平板单一菌落，通过反复分离最终获得浸矿菌纯培养。扫描电镜及实际菌落形态照片表明：浸矿菌在固体平板表面形成圆形粘液状米黄色菌落，菌落内部结合较为松散，菌落直径可达2 mm左右，单个细菌通过胞外附属结构或物质与培养基基质紧密相连。

［1］邓敬石. 高温嗜热菌浸出硫化矿的研究现状及展望[J]. 云南冶金, 2005, 34(1): 21-25.

［2］周吉奎. 三类生物冶金微生物菌种的选育及其与矿物作用研究[D].长沙：中南大学(博士学位论文), 2004.

［3］Henry L, Ehrlich, Corale L.Brierley. Microbial mineral recovery[M]. Newyork: McGraw-Hill Publishing Company Professional and Reference Division composition unit, Part I:Bioleaching and biobene-ficiation, 1990: 29-35.

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［5］丁建南, 王淀佐, 邱冠周. 几种高温浸矿菌的分离鉴定及其应用基础与浸矿潜力研究［D］. 长沙：中南大学(博士学位论文), 2007.

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［7］ 刘露, 张勇, 李铭, 吴东平, 李想. 氧化亚铁硫杆菌培养的“瓶颈”问题研究与突破[J]. 洁净煤技术, 2007, 13(5): 27-30.

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［9］ 夏金兰, 邱冠周, 巩三强, 潘佳民, 等. 极端嗜酸热古菌分离纯化固体培养基及配制方法: 中国, 20110095165.8. 2011［P］.

Application Potential of a New-type Coagulator for Purifying Bioleaching Microorganisms by the Solid Plate Method

XIA Jin-Lan1,2，PAN Jia-Min1， GONG San-Qiang1，JIN Xue-Jie1，NIE Zhen-Yuan1，YAN Yi-Ying1，QIU Guan-Zhou1,2
（1. Central South University, Hu’nan Changsha 410083, China；2. Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education, Hu’nan Changsha 410083, China）

A kind of solid plate culture medium for purifying bioleaching microorganisms was designed by using a new high temperature resistance and acid resistance coagulator. Combined with the water-dish culture method,solid plate culture and purifying of thermophilic bioleaching bacteria(Acidianus manzaensis), midthermophilic bioleaching bacteria(Ferroplasma thermophilum L1) ,mesophilic bioleaching bacteria (from the natural acid mine drainage) were realized. The scanning electron microscope revealed that the colony inner was incompact, bacteria in the colony tightly adhered to stroma of the solid plate by extracellular appendages. These results indicate that the new solid plate will have great potential for screening, identification, genetic engineering of leaching bacteria.

Coagulator； Solid culture medium； Bioleaching bacteria； Scanning electron microscope

TQ 314

A

1671-0460（2012）06-0624-06

2012-03-10

夏金兰（1964-），男，湖南株洲人，教授，博士学位，1988年毕业于武汉大学分析化学专业，研究方向是极端环境微生物及其应用基础。E-mail：jlxia@mail.csu.edu.cn。

潘佳民（1983-），男，硕士，研究方向:微生物学。E-mail：panjia_9@163.com。