特异性siRNA下调Cr－1基因表达对人结直肠癌细胞侵袭的影响

朱祥 马圭 祁卫东 蒋鹏程 范钰

（江苏大学附属人民医院肿瘤研究所 江苏镇江 212002）

Cripto－1基因最初是通过克隆人畸胎瘤细胞系中的互补DNA文库得到，故相应地命名为畸胎瘤衍生生长因子－1（teratocarcinoma－derived growth factor－1，TDGF1），定位在人类染色体3p21.3［1］，编码cripto蛋白，故一般称为Cr－1基因。研究发现，Cr－1基因在许多恶性实体瘤如结直肠癌、胃癌、胰腺癌、阴茎癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈过度表达，而它在正常组织中都不表达或低表达［2，3］。有研究发现，Cr－1基因与某些肿瘤如结直肠癌［4～8］侵袭有关。但国内目前尚无关于此基因在结直肠癌细胞侵袭方面的研究。

本课题组借助于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以化学合成Cr－1基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染处理结直肠癌SW480细胞，观察了Cr－1基因siRNA转染对癌细胞侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人结直肠癌SW480细胞，本院组织生物标本库冻存。Cr－1抗体购自Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自Invitrogen公司。

1.1.2 siRNA序列 根据Cr－1基因mRNA序列特点，设计合成了6个siRNA。另外，设计了一个错配 siRNA（正义 链：5＇－UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd－3 ＇； 反 义 链： 5 ＇－ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT－3＇）作为对 照。所有siRNA均由美国Dharmacon公司采用化学合成方法合成。Cripto－1siRNA序列见表1。

表1 Cripto－1siRNA 序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染处理 人结直肠癌SW480细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1ml／well，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。细胞分组：（1）空白对照组（Con－A）：未经任何处理的结直肠癌细胞；（2）空载对照组（Con－B）：即脂质体对照组；（3）错配对照组（Scr－siRNA）；（4）siRNA 组：10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同浓度（3.125、6.25、12.5nmol／L）的已用脂质体包埋的siRNA。

1.2.2 结直肠癌细胞Cr－1基因检测

1.2.2.1 mRNA水平 采用荧光实时定量RTPCR检测。收集细胞，以TRIzol抽提细胞总RNA，取总RNA 1μg，以oligo dT（15mer）为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2μL为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书进行。Cripto－1定量 PCR 引物：上游：5＇－CAATTCGGCCTCGGTCTTC－3＇；下游：5＇－TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT－3＇。 FAM 探 针：5＇－CATGGGTGCCCCGACGTTGC－3＇－TAMRA。以3－磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参。PCR反应条件为：95℃，预变性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45 s；35个循环后，72℃再延伸7min。

1.2.2.2 蛋白水平 采用蛋白质印迹方法检测。提取对照组和各实验组细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规Western blot检测。利用Kodak Digital Science 1DImage Analysis Software（Eastman Kodak Company，USA）测定 Western blot条带净灰度值，并与内参照β－actin的测定结果相比较，计算其比值。

1.2.3 软琼脂集落形成试验 参照文献方法［9］，进行软琼脂集落培养试验，观测Cr－1siRNA对结直肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响。

1.2.4 体外侵袭试验 参照文献方法［10］，在Boyden小室模型中进行观察。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

2 结 果

2.1 Cr－1siRNA的筛选 为探讨Cr－1基因在结直肠癌细胞侵袭中的作用，本研究首先根据该基因mRNA序列特点，设计并用化学方法合成了3个siRNA转染结直肠癌SW480细胞，48h后收集细胞，采用实时定量RT－PCR检测Cr－1基因mRNA水平。结果显示，这3个siRNA均能明显抑制Cr－1mRNA水平，以S1效果最好，而空载对照组和错配对照组Cr－1mRNA水平无明显变化（P＞0.05）（见图1）。

图1 Cr－1siRNA转染对结直肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响

2.2 siRNA敲除对结直肠癌细胞Cr－1基因的影响 本研究进一步采用S1siRNA转染结直肠癌SW480细胞，分别采用实时定量PCR和蛋白质印迹检测Cr－1基因mRNA和蛋白水平。结果显示，与对照组细胞比较，siRNA组Cr－1mRNA和蛋白水平明显降低（P＜0.05，见图2、图3）。

图2 siRNA对结直肠癌SW480细胞Cr－1mRNA水平的影响

图3 siRNA对结直肠癌SW480细胞Cr－1蛋白水平的影响

2.3 Cr－1siRNA转染对结直肠癌细胞软琼脂集落形成的影响 软琼脂集落形成试验结果发现，经Cr－1siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少（P＜0.05，见图4）。

图4 Cr－1siRNA转染对结直肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响

2.4 Cr－1siRNA转染对结直肠癌细胞侵袭的影响 采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且与浓度相关（P＜0.05，见图5）。

图5 Cr－1siRNA转染对结直肠癌SW480细胞体外侵袭的影响

3 讨 论

在基因研究领域中，RNAi和siRNA已引起了广泛的注意。RNAi是近年来发现的一种调节mRNA的生物学现象，能够使基因的mRNA被相应的双链RNA分子敲除，其效果要远强于正义和反义RNA［11］。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。而siRNA是指RNAi过程中在细胞内产生的长约21～25核苷酸（nt）的小双链RNA分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子。而且已有人工合成的siRNA，具有明显的敲除相应基因mRNA的效果［10，12～14］。由于siRNA 具有高效敲除基因表达的工具，已被广大科学工作者用来研究基因功能和基因治疗的工具。

为了解Cr－1基因在结直肠癌细胞侵袭中的作用，本研究根据Cr－1基因mRNA特点，设计siRNA序列，并用化学方法合成，转染结直肠癌SW480细胞后，分别采用荧光实时定量RT－PCR和wetern blot方法检测Cr－1基因mRNA和蛋白水平，结果发现，转染组细胞Cr－1基因mRNA和蛋白水平明显下降，提示Cr－1siRNA转染成功。说明该siRNA可作为研究Cr－1基因功能的有力工具。

接着，我们在体外观察了Cr－1基因siRNA转染对结直肠癌SW480细胞侵袭的影响。正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性（anchorage dependence）。肿瘤细胞可以锚着不依赖性状态生长。肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。软琼脂集落培养试验结果显示，经Cr－1siRNA转染处理的结直肠癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。

Boyden小室模型或Transwell是检测癌细胞侵袭试验的经典模型，已被广泛应用于探讨癌细胞侵袭的相关研究中。本研究将经Cr－1siRNA转染处理的结直肠癌549细胞置于Boyden小室模型中，结果显示，转染组结直肠癌细胞穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。提示Cr－1下调可抑制结直肠癌细胞的体内外侵袭能力。

本研究提示，Cr－1基因在结直肠癌细胞侵袭中起着重要的作用，以siRNA转染下调可明显抑制结直肠癌细胞的侵袭能力，其内在机制尚需进一步深入研究。

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