地米樟酚乳膏微生物限度检查方法的验证

彭贤东 ，龙 凤 ，唐志立 ，刘 峥

(1.四川省南充市中心医院药学部，四川 南充 637000; 2.四川省药品质量研究所，四川 成都 610036)

地米樟酚乳膏是我院使用多年的医院自制制剂，临床用于治疗局限性瘙痒症、湿疹、皮炎等各种变应性皮肤病。为更好地控制与完善制剂质量，配合医院制剂注册申报，笔者参考文献[1－3]对该制剂的微生物限度检查方法进行了验证，并获得制剂批准文号(川药制字H20101001)。现将其微生物限度检查方法验证报道如下。

1 仪器与材料

DC82型隔水式电热恒温培养箱(上海南汇老港机械厂);LRH－150B型生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)。地米樟酚乳膏(南充市中心医院自制，批号为100216，规格为每10 g含醋酸地塞米松5 mg、樟脑0.25 g与苯酚0.1 g);5%聚山梨酯80－pH 7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液按文献[1]进行制备，高压蒸汽灭菌法灭菌，作为稀释液。营养肉汤培养基(批号为081103);改良马丁培养基(批号为080424);改良马丁琼脂培养基(批号为080911);营养琼脂培养基(批号为0810163);玫瑰红钠琼脂培养基(批号为0810233);胆盐乳糖培养基(批号为081215)，均由中国药品生物制品检定所提供。大肠埃希菌[CMCC(B)44102];金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003];铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104];枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003]均为第3代，由四川省药品质量研究所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌的营养肉汤培养物1 mL，加入9mL 0.9% 氯化钠注射液 10 倍稀释至 10－5～10－7，菌落数约为50～100 cfu/mL，作活菌液计数备用。取经25℃培养24～48 h的白色念珠菌的改良马丁培养基1mL，加入9mL0.9%氯化钠注射液 10 倍稀释至 10－5～10－6，菌落数约为 50 ～100 cfu/mL，作活菌液计数备用。取经25℃培养1周的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，加3～5mL0.9%氯化钠注射液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1mL加9mL 0.9%氯化钠注射液，逐管10倍稀释为10－5，菌落数约为50～100cfu/mL，做活菌液计数备用。

2.2 供试品溶液制备

本品为乳膏剂，加入pH 7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液中固体不能均匀分散。根据文献[1]取本品10 g，加45℃的5%聚山梨酯80－pH 7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100mL，在45℃水浴中放置约20 min，并不时振摇使其分散均匀，制成1∶10供试品溶液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

2.3.1 平皿法

分别取1∶10供试品溶液1mL/皿，分别同时加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。其中三种细菌用营养琼脂培养基培养，白色念珠菌和黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基培养。各平行制备两皿。分别置规定温度培养、观察。试验结果见表1。大肠埃希菌回收率高于70%，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均低于70%。该品种有抑菌作用，不能采用平皿法进行菌落计数。

表1 平皿法计数回收率测定

2.3.2 培养基稀释法

取1∶10供试品溶液，按0.2mL/皿加入平皿，分别同时加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。各平行制备两皿，进行3次独立平行试验。分别置规定温度培养、观察。结果见表2。可见，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌回收率均高于70%，说明此方法可消除本品对细菌的抑菌作用，细菌计数可用此方法。黑曲霉的回收率低于70%，不能消除对黑曲霉的抑菌作用。取1∶10供试品溶液，按0.1mL/皿加入平皿，分别同时加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。各平行制备两皿，进行3次独立平行试验。分别置规定温度培养、观察。结果见表3。可见，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%，此方法可消除本品对霉菌的抑菌作用，可按该方法进行霉菌及酵母菌的计数，与文献[4－5]报道的方法一致。

表2 培养基稀释法(0.2mL/皿)计数回收率

表3 培养基稀释法(0.1mL/皿)计数回收率

2.3.3 回收率计算

试验组:按上述各方法分别取供试品溶液与50～100 cfu/mL试验菌数，同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72 h，观察结果。菌液组:测定每一菌株加的试验菌数(cfu/mL)。供试品溶液对照:按上述各方法分别取供试品溶液，加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72 h，观察结果。试验组的菌回收率=[(试验组的平均菌落数－供试品溶液对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数]×100%;

2.4 控制菌检查法验证

金黄色葡萄球菌:取1∶10供试品溶液10mL，分别接种至3瓶200 mL营养肉汤培养基中，其中1瓶加入1mL金黄色葡萄球菌(10～100个/mL)为阳性菌对照，1瓶加入1mL大肠埃希菌(10～100个/mL)为阴性菌对照，按金黄色葡萄球菌常规检查法检验。结果见表4。可见，阳性菌对照中检出金黄色葡萄球菌，阴性菌对照未检出金黄色葡萄球菌，表明本品的金黄色葡萄球菌检查可按常规方法。

表4 金黄色葡萄球菌常规法检查结果

铜绿假单胞菌检查:取1∶10供试品溶液10mL，分别接种至3瓶100mL胆盐乳糖培养基中，其中1瓶加入1mL铜绿假单胞菌(10～100个/mL)为阳性菌对照，1瓶加入1mL金黄色葡萄球菌(10～100个/mL)为阴性菌对照，按铜绿假单胞菌检查法检验，结果见表5。可见，阳性菌对照中检出铜绿假单胞菌，阴性菌对照未检出铜绿假单胞菌，表明采用常规法可进行本品的铜绿假单胞菌检查。

表5 铜绿假单胞菌常规法检查结果

3 讨论

对地米樟酚乳膏中含有的抑菌成分进行微生物限度检查时，要求供试品自身在试验条件下能有效地排除其抑菌作用。根据文献规定[1]，细菌计数、霉菌和酵母菌计数方法验证的回收率应不低于70%。由本验证结果表明，所建立的微生物限度检查方法可用于地米樟酚乳膏微生物限度检查，消除本品抑菌活性对试验的干扰。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社，2010:附录 107－116.

[2]苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社，2007:209－227.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2010:351－407.

[4]王亚南，魏立平，张润婕，等.含苯酚制剂的微生物限度检测方法的验证 [J].中国药房，2007，18(28):2 217－2 219.

[5]别小琳，王 灿.复方樟脑乳膏微生物限度检查方法的建立[J].四川生理科学杂志，2010，32(3):106 －108.