复方丙酸倍氯米松乳膏微生物限度检查方法的验证

廖祥茹，陈 晨，郑汉平，刘祖雄

(中国人民解放军广州军区武汉总医院药剂科，湖北 武汉 430070)

复方丙酸倍氯米松乳膏为医院制剂，含有丙酸倍氯米松、氯霉素等成分，临床用于过敏性与炎症性皮肤病和相关疾病。根据2010年版《中国药典(二部)》[1]，采用薄膜过滤法对其进行细菌、霉菌和酵母菌计数的验证以及控制菌金黄色葡萄球菌的检查，采用培养基稀释法对控制菌铜绿假单胞菌进行检查。报道如下。

1 仪器与材料

HTY－2000型集菌仪、可拆卸式薄膜过滤器(杭州高得医疗器械有限公司);微孔滤膜(杭州泰林生物技术设备有限公司，孔径0.45μm);SW－CJ－IFD/T型洁净工作台、BSC－1300ⅡA2型生物安全柜(苏净集团安泰公司);PYX－DHS型隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂);SPX－250B－Z型生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。复方丙酸倍氯米松乳膏(广州军区武汉总医院药剂科制剂室，规格为30 g，批号分别为20110822，20111212，20120217)。营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，均由北京三药科技有限公司生产，为符合药典规定的干燥培养基。0.9%无菌氯化钠溶液，按2010年版《中国药典(二部)》附录方法配制。大肠埃希菌[CMCC(B)44102]第4代、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]第4代、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]第4代、白色念珠菌[CMCC(F)98001]第3代、黑曲霉[CMCC(F)98003]第4代、铜绿假单孢菌[CMCC(B)10104]第3代，均由湖北省药监所提供。

2 方法

2.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24 h，分别取上述培养物1mL，加0.9%的无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每1mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28℃下培养24～48 h，取培养物1 mL，加入无菌0.9%氯化钠注射液9mL中，10倍递增稀释制成每1mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液;接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～28℃下培养5～7 d，加入5mL含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内，取原液1mL，加入含0.05%(V/V)聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠注射液9mL中，10倍递增稀释制成每1mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液制备

取样品5 g，加至熔化的(温度不超过45℃)含2.5 g司盘80、5 g聚山梨酯80无菌混合物的锥形瓶中，用无菌玻棒搅拌成团后，分次加入45℃无菌0.9%氯化钠注射液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，振摇均匀。作为1∶20供试液，备用。

2.3 菌落计数方法的验证

2.3.1 平皿法、培养基稀释法

试验组:取1∶20供试液2mL，0.5mL和各试验菌液(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)1mL，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，分别置30～35℃下培养3 d和23～28℃下培养5 d，按平皿法测定其菌数。

菌液组:分别取上述稀释的试验菌液1mL注入平皿内，每种试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

供试品对照组:取1∶20供试液2mL和0.5mL，按照试验组方法操作，不加菌液，测定供试品的本底菌数。

稀释剂对照组:取稀释剂1mL按照试验组操作。

结果见表1和表2。可见，平皿法和培养基稀释法3次试验5株菌株均不同程度受到了抑制，说明常规平皿法和培养基稀释法均不能有效去除其抑菌成分，须重新建立细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

2.3.2 薄膜过滤法

试验组:取1∶20供试液20mL，按10mL/膜，加入含100mL稀释液的薄膜过滤器中全量过滤，用冲洗液冲洗400 mL。最后1次加入1mL(50～100 cfu)各试验菌，取出滤膜菌面朝上贴于已制备的营养琼脂培养基平板上或玫瑰红钠琼脂培养基平板上，平行制备2皿，置30～35℃下培养3 d或23～28℃下培养5 d。逐日观察，按平皿法测定其菌数。

菌液组:分别取上述试验菌液1mL注入薄膜过滤器内过滤，贴膜。每种菌平行制备2张滤膜，分别测定所加的试验菌数。

供试品对照组:取1∶20供试液20 mL按照试验组方法操作，不加菌液，测定样品本底数。

稀释剂对照组:取稀释剂1mL按照试验组方法操作。重复试验3次。

结果见表3。可见，用400 mL冲洗时，各试验菌株的回收率均达到70%以上。说明薄膜过滤法可用于复方丙酸倍氯米松乳膏的细菌、霉菌及酵母菌计数，冲洗量定为400mL。

表1 常规平皿法回收率测定结果(%)

表2 薄膜过滤法回收率测定结果(%)

表3 控制菌铜绿假单胞菌验证结果

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 铜绿假单胞菌检查方法的验证

试验组:取1∶20的供试液20mL及1mL铜绿假单胞菌菌液，接种至200mL的胆盐乳糖培养基内，于35℃培养24 h，取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上，培养24 h，依相应控制菌检查法进行检查。

阴性菌对照组:取1∶20的供试液20mL及1mL大肠埃希菌菌液，接种至200mL的胆盐乳糖培养基内，按试验组方法操作。

结果，试验组检出铜绿假单胞菌，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌。说明200mL胆盐乳糖培养基可用于复方丙酸倍氯米松乳膏铜绿假单胞菌的检查。

2.4.2 金黄色葡萄球菌检查方法的验证

试验组:取1∶20的供试液20mL，按10mL/膜，加入含100mL稀释液的薄膜过滤器中全量过滤，用冲洗液冲洗400mL。取出滤膜加至100mL的营养肉汤培养基中，加入1mL金黄色葡萄球菌菌液，于35℃下培养24 h，取上述培养物，划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72 h，依相应控制菌检查法进行检查。

阴性菌对照组:取1∶20的供试液20mL及1mL大肠埃希菌菌液，按试验组方法操作。

结果见表4，试验组检出了金黄色葡萄球菌，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌。说明薄膜过滤法(冲洗量400mL)可用于复方丙酸倍氯米松乳膏金黄色葡萄球菌的检查。

表4 控制菌金黄色葡萄球菌验证结果

3 讨论

在验证过程中，笔者曾试验多种供试液制备方法，最终采用了文中所述方法，该法制备的供试液较易通过滤膜，且回收率比其他方法理想。

稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，说明采用含适量聚山梨酯80，司盘80的0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释液对试验不产生干扰。

控制菌铜绿假单胞菌检查采用培养基稀释法;在控制菌金黄色葡萄球菌的检查中，培养基稀释法未能有效检出阳性菌，故采用薄膜过滤法，冲洗后取出滤膜加至营养肉汤培养基中。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:人民卫生出版社，2010:附录 107－116.