弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫球蛋白基因重排特点及规律研究

潘鑫艳，王 丽，陈 玥，黎贵芸，杨丽琳，杨举伦

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphomas，NHL)最常见的类型，占所有NHL的30% ～40%，呈中 －高度恶性。DLBCL的形态学分型由于主观性强、可重复性差，难以向临床提供有效、准确的治疗和预后信息［1］。免疫组化技术对区分DLBCL的免疫学表型有重要的价值［2］，然而对于一些疑难病例，形态学和免疫组化也难以分辨。近年来随着分子生物学的发展，基因异常检测逐渐成为恶性淋巴瘤诊断的重要补充手段［3］。免疫球蛋白(Ig)基因重排是B淋巴细胞克隆的特异性标志［4-6］，是目前较适合区分DLBCL免疫学表型的检测手段［7］。

2000年Alizadeh等［8］首先通过对基因表达谱结果分析，提出DLBCL可分为2型，即生发中心B细胞型(germinal center B-cell-like，GCB)和活化B细胞型(activated B-cell-like，ABC)。2004年 Hans等［9］以cDNA微阵列为参照对DLBCL进行亚分类，提出DLBCL分为GCB和非GCB(non-GCB)2种类型，二者的预后不同［10-14］。目前大多数文献只对其检测率进行探讨，本实验利用BIOMED-2克隆分析系统研究DLBCL中Ig基因重排规律，探讨GCB和non-GCB中Ig基因重排特点，以期为DLBCL的诊断及分型提供更为简捷的检测途径，同时为临床应用提供更为可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本:收集成都军区昆明总医院病理科2010年1月—2012年1月经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的46例手术切除的淋巴组织病变标本，全部标本均经2名有经验的病理医师结合形态学及免疫组化确认为DLBCL，以15例反应性增生病变作为阴性对照。

1.1.2 主要试剂:免疫组化试剂CD10、MUM1、Bcl-6购自Dako公司;QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit购自德国QIAGEN公司;10×PCR buffer、rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司;2.5 mmol/L dNTP Mixture、6×Loading buffer、50 bp Marker购自天根生化科技公司;BIOMED-2引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法:采用Envision法，以PBS代替一抗作为空白对照，＞30%的肿瘤细胞染色阳性视为阳性病例。依据Hans等［9］方法对DLBCL进行免疫分型，GCB组:CD10(+)或CD10(－)时，Bcl-6(+)，同时MUM1(－);non-GCB 组:CD10(－)，若Bcl-6(+)则同时MUM1(+)。

1.2.2 石蜡样本基因组DNA提取:用75%乙醇擦拭刀片或使用新刀片以保证无交叉污染。视组织大小切8～10片，8 μm厚的石蜡切片置于1.5 ml灭菌离心管中，二甲苯脱蜡4次;无水乙醇重复3次去除二甲苯;37℃恒温器干燥组织。用DNA提取试剂盒提取石蜡组织基因组DNA，紫外分光光度计测量样品DNA的浓度、纯度，其OD260/OD280应介于1.7 ～2.0，OD260/OD230≥1.7，对样品不纯或浓度不足的样本重新提取DNA。

1.2.3 引物设计:选用了BIOMED-2引物系统中检测Ig基因克隆性重排的47条引物(表1)［15］，这些引物组合后应用于检测重链(IGH)和轻链(IGκ和IGλ)，其中IGH 分成5 组:IGH-A、B、C、D、E，用于检测VH-JH;IGκ分成2组，用于检测 Vκ-Jκ和 Vκκde，包括 IGκ-A、B;IGλ 用于检测 Vλ-Jλ。同时还包含了内对照S引物5条，其扩增产物片段长度分别为 100、200、300、400 和 600 bp。

表1 BIOMED-2标准化的基因重排分析引物系统

1.2.4 PCR 扩增:采用 25 μl扩增体系:0.1 μmol/L引物，10 × PCR buffer，0.2 mmol/L dNTP Mixture，2 U rTaq DNA聚合酶。PCR反应条件为:94℃预变性，10 min;94℃，45 s;60℃，45 s;72℃，90 s;循环40次，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.5 异源双链核酸分子分析及聚丙烯酰胺电泳检测:PCR 产物置于95℃、5 min，4℃、1 h，使其快速随机复性，形成异源双链核酸分子。取上述异源双链核酸分子7 μl进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，以50 bp Marker为分子量标准对照，0.5×TBE电泳缓冲液，电压80 V、电泳10 min;而后电压110 V、电泳1.0 ～1.5 h;EB 染色 5 min，紫外凝胶成像仪下观察。

1.3 统计学处理 应用SPSS 11.0软件进行统计学处理，其中重(轻)链阳性率比较时，若该例标本中同时扩增出几种重(轻)链反应管的阳性条带，则只统计为1例;而在统计每个反应管的阳性率时，若该例标本中扩增出几种重(轻)链反应管阳性条带就统计为几例。所有数据均采用χ2检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 免疫组化分型 采用CD10、MUM1、Bcl-6 3种抗体染色对DLBCL进行蛋白水平分子分型［9］，将本实验选取的46例DLBCL划分成 GCB 12例，non-GCB 34例。

2.2 DLBCL的Ig基因重排 46例DLBCL经Ig基因重排分析显示，除1例样本因提取的基因组DNA降解严重导致实验失败外，其余的45例样本均扩增出Ig克隆性重排条带(图1)，利用BIOMED-2引物系统对DLBCL的检测敏感性为97.8%(45/46);15例反应性增生病例中未出现Ig基因的克隆性重排，检测特异性为100.0%(15/15)。46例样本中IGH克隆性重排的阳性例数为42例(91.3%);IGκ克隆性重排的阳性例数为38例(82.6%)，IGλ克隆性重排的阳性例数为17例(37.0%);重排条带主要集中于检测重链的IGH-A、IGH-C反应管以及检测轻链的 IGκ-A、IGκ-B 反应管(表2)。

表2 弥漫性大B细胞淋巴瘤Ig基因重排检测结果(n=46)

2.3 GCB和non-GCBIg基因重排比较 GCB和non-GCB重链IGH基因重排阳性率分别为91.6%(11/12)和 94.1%(32/34)，差异无统计学意义(P＞0.05)。而轻链基因重排阳性率分别为58.3%(7/12)和91.2%(31/34)，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 弥漫性大B细胞淋巴瘤GCB和non-GCBIg基因重排检测结果

图1 弥漫性大B细胞淋巴瘤部分样品Ig基因重排经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

3 讨论

DLBCL是一组临床表现、组织形态、免疫表型、生物学行为及预后等方面具有很大异质性的大B淋巴细胞来源的肿瘤，其病理诊断是病理工作中的难点。一些DLBCL的鉴别、诊断、分型仅依靠形态学和免疫组化难以实现，病理医师往往难以作出肯定的判断，甚至误诊，受体基因重排的克隆性分析技术为解决这一问题提供了一条途径。20世纪80年代末，分子生物学和分子细胞遗传特征已成为DLBCL诊断和研究中不可缺少的部分［16］。近年来，PCR技术用于检测Ig基因重排在DLBCL诊断与鉴别诊断中的作用获得了肯定［17］。

Ig基因克隆性重排主要集中在重链可变区V基因，IGH之所以成为克隆性检测的首选目标，主要原因是由于大多数B细胞肿瘤均会发生IGH基因重排。因此，多年来研究者依据IGH基因来进行克隆性检测，而在应用IGκ和IGλ方面，临床实践和研究均不多。但是理论和已经发表的一些研究成果表明，对轻链的研究在一定程度上能够提高克隆性重排检出率［18］。以往研究显示 B细胞淋巴瘤IGH基因重排的阳性检出率为50% ～85%［16，19-20］。BIOMED-2方案是2003年由欧共体7国47个研究机构研究建立的多重PCR引物系统［21］，该方案引入对IGκ和IGλ两条轻链的检测后，特别是IGκ包括了 Vκ-Jκ(IGκ-A)和 κde(IGκ-B)片段的检测;而且κde重排方式也不受体细胞高突变的影响［22-23］，进一步提高了对成熟B细胞性淋巴瘤的检出率(95% ～100%)［18，24-26］。因此，在对 B 细胞淋巴瘤的基因重排检测中对轻链的检测也显得尤为重要。

本研究利用BIOMED-2引物系统对46例DLBCL进行了 Ig基因重排检测，检出率达到97.8%，检测特异性为 100.0%，与文献报道一致［25］。46例DLBCL样本中 IGH克隆性重排的阳性检出率为91.3%;IGκ克隆性重排的阳性检出率为82.6%，其中IGκ-A克隆性重排的阳性检出率为56.5%，高于文献报道的 29.2%［27］;IGκ-B 克隆性重排的阳性检出率为26.1%，与文献报道的25.0%一致［27］。IGλ克隆性重排的阳性检出率为37.0%。结果显示IGH克隆性重排的阳性检出率最高，IGκ次之，IGλ最低。

2008年WHO将DLBCL进行免疫学分型，分为GCB和non-GCB 2种类型［28］。这2种分子类型的DLBCL患者预后差别显著，5年生存率分别为70%和12%，non-GCB组比GCB组低，若对DLBCL患者早期诊断、根据分型予强力化疗，近半数可获得缓解［29］。因此，早期诊断、治疗对提高DLBCL患者的生存率意义重大。本研究讨论了DLBCL GCB和non-GCB中，Ig基因重链(IGH)和轻链(IGκ和IGλ)的重排规律和特点，力求找到一种更为简捷、准确的检测途径。研究结果显示，GCB和non-GCB的重链IGH基因重排差异无统计学意义，而轻链重排条带分布具有显著的特点和规律:GCB的IGκ-B克隆性重排的阳性检出率明显高于non-GCB型，IGκ-A、IGλ克隆性重排的阳性检出率明显低于non-GCB型。蒋会勇等［30］利用半巢式PCR对GCB进行了IGH基因重排相关性检测，结果显示IGH基因重排的检测可协助确定部分GCB的DLBCL。然而通过本研究发现，轻链基因的重排检测也可以协助DLBCL分型。

目前，大多数文献通过免疫组化对non-GCB和GCB预后进行研究表明，前者预后比后者差，而Ig基因重排与其预后关系的研究甚为少见［10，29，31-34］。本文发现GCB和non-GCB中轻链重排条带差异有统计学意义，该现象与其预后是否关联，尚需进一步验证。对于一些疑难病例，特别是早期和微量标本，基因诊断尤有独到之处，但当基因重排检测与病理组织学及免疫组化结果有冲突的时候，务必将3种检查结合起来综合分析［35-37］。

［1］A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin's lymphoma.The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project［J］.Blood，1997，89(11):3909-3918.

［2］郑颂国，陆孝禹，张容轩，等.恶性B淋巴细胞性淋巴瘤克隆性重排检测研究［J］.肿瘤，1999，19(5):285-288.

［3］陈愉，赵彤，韩西群，等.弥漫性大B细胞淋巴瘤克隆性基因重排检测研究［J］.东南国防医药，2006，8(5):336-337，345.

［4］Braunschweig R，Baur A S，Delacretaz F，et al.Contribution of IgH-PCR to the evaluation of B-cell lymphoma involvement in paraffin-embedded bone marrow biopsy specimens［J］.Am J Clin Pathol，2003，119(5):634-642.

［5］Theriault C，Galoin S，Valmary S，et al.PCR analysis of immunoglobulin heavy chain(IgH)and TcR-gamma chain gene rearrangements in the diagnosis of lymphoproliferative disorders:results of a study of 525 cases［J］.Mod Pathol，2000，13(12):1269-1279.

［6］陈云昭，李锋，胡文浩，等.石蜡包埋B细胞性恶性淋巴瘤组织克隆性免疫球蛋白重链基因重排检测研究［J］.肿瘤学杂志，2005，11(3):176-178.

［7］易基群，林桐榆，何友兼.荧光定量PCR分析弥漫大B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链基因重排表达［J］.中国癌症杂志，2007，17(8):619-623.

［8］Alizadeh A A，Eisen M B，Davis R E，et al.Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling［J］.Nature，2000，403(6769):503-511.

［9］Hans C P，Weisenburger D D，Greiner T C，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray［J］.Blood，2004，103(1):275-282.

［10］彭晚娇，姚丽青，郑智勇.淋巴结外弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型的病理学研究［J］.实用癌症杂志，2010，25(1):59-61.

［11］Wright G，Tan B，Rosenwald A，et al.A gene expression-based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(17):9991-9996.

［12］Rosenwald A，Wright G，Chan W C，et al.The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma［J］.N Engl J Med，2002，346(25):1937-1947.

［13］Monti S，Savage K J，Kutok J L，et al.Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response［J］.Blood，2005，105(5):1851-1861.

［14］虞海荣，孙振柱.免疫学分型在判定弥漫性大B细胞淋巴瘤预后中的临床意义［J］.新疆医科大学学报，2008，31(5):559-560，563.

［15］van Dongen J J，Langerak A W，Bruggemann M，et al.Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations:report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936［J］.Leukemia，2003，17(12):2257-2317.

［16］许良中，邱柄森，许越香.现代恶性淋巴瘤病理学［M］.上海:科学技术文献出版社，2002:150.

［17］Igarashi T，Itoh K，Kobayashi Y，et al.PhaseⅡ and pharmaco kinetics study of rituximab with eight weekly infusions in relapsed aggressive B-cell non-Hodgkins lymphoma［J］.Proc Am Soc Clin Oncol，2002，21:286a.

［18］陈玥，王丽，潘鑫艳，等.Ig基因重排检测在B细胞性淋巴瘤诊断中的应用［J］.诊断病理学杂志，2011，18(3):186-189.

［19］Gurbity T P，Bagdi E，Groen N A，et al.Increased sensitivity of B-cell clonality analysis in formalin-fixed and paraffin-embedded B-cell lymphoma samples using an enzyme blend with both 5'— ＞3'DNA polymerase and 3'—＞5'exonuclease activity［J］.Virchows Arch，2003，443(5):643-648.

［20］Lombardo J F，Hwang T S，Maiese R L，et al.Optimal primer selection for clonality assessment by polymerase chain reaction analysis.Ⅲ.Intermediate and high-grade B-cell neoplasms［J］.Hum Pathol，1996，27(4):373-380.

［21］Sandberg Y，van Gastel Mol E J，Verhaaf B，et al.BIOMED-2 multiplex immunoglobulin/T-cell receptor polymerase chain reaction protocols can reliably replace Southern blot analysis in routine clonality diagnostics［J］.J Mol Diagn，2005，7(4):495-503.

［22］van der Burg M，Tumkaya T，Boerma M，et al.Ordered recombination of immunoglobulin light chain genes occurs at the IGK locus but seems less strict at the IGL locus［J］.Blood，2001，97(4):1001-1008.

［23］van Zelm M C，van der Burg M，de Ridder D，et al.Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression［J］.J Immunol，2005，175(9):5912-5922.

［24］王丽，陈玥，潘鑫艳，等.Ig/TCR基因重排分析联合EBER原位杂交检测在原发性胃肠道淋巴瘤诊断中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2011，27(6):580-585.

［25］张婧，吴迎辉，孔海鹰，等.BIOMED-2聚合酶链反应Ig基因重排对成熟非霍奇金B细胞淋巴瘤诊断的价值［J］.中华病理学杂志，2009，38(11):739-744.

［26］Payne K，Wright P，Grant J W，et al.BIOMED-2 PCR assays for IGK gene rearrangements are essential for B-cell clonality analysis in follicular lymphoma［J］.Br J Haematol，2011，155(1):84-92.

［27］李洁.B细胞恶性肿瘤免疫球蛋白基因重排的相关研究及临床意义［C］.广州:南方医科大学，2008.

［28］Swerdlow S H，Campo E，Harris N L，et al.WHO classifi-cation of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues［EB/OL］.4 th ed.Lyon:International Agency for Research on Cancer，［2008-04-02］.http://apps.who.int/booko-rders/anglais/detart1.jsp? sesslan =1＆codlan=1＆codcol=70＆codcch=04002

［29］李亮，郝云良，崔文，等.弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫学亚型的研究［J］.济宁医学院学报，2010，33(2):114-116.

［30］蒋会勇，陈愉，张三泉，等.弥漫大B细胞淋巴瘤bcl-2/IgH基因重排与GCB分子亚型的相关性［J］.第四军医大学学报，2006，27(5):420-423.

［31］宋恩霖，熊小亮，艾有生，等.Ki-67在GCB及non-GCB弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义［J］.江西医药，2010，46(2):111-113.

［32］李娟，徐刚.弥漫性大B细胞淋巴瘤分型研究进展［J］.实用医院临床杂志，2007，4(6):42-44.

［33］叶子茵，曹亚兵，林桐榆，等.弥漫大B细胞淋巴瘤免疫表型分型与预后的关系［J］.中华病理学杂志，2007，36(10):654-659.

［34］曹永峰，魏金芝，宋诸臣，等.弥漫性大B细胞淋巴瘤116例免疫亚型研究［J］.南通大学学报:医学版，2011，31(3):228-229.

［35］杨华，刘小丽，刘华庆.弥漫性大B细胞淋巴瘤临床病理分析［J］.遵义医学院学报，2008，31(5):479-482.

［36］陆俐丽，林贤东，郑天荣，等.B细胞淋巴瘤IgH基因重排的检测及临床应用［J］.福建医药杂志，2007，29(6):77-79.

［37］陶琨，朱雄增，徐薇苓，等.弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床病理和免疫组织化学特征［J］.中华病理学杂志，2002，31(2):112-115.