利用电导率仪法检测泰乐菌素高效降解菌的生长量

谢丽 孙瑞珠 马玉龙 李俊莲

摘要：离心收集泰乐菌素降解菌，超声破碎菌体后，测定不同浓度菌液的电导率值。结果表明，完全破碎后的菌液电导率值与细胞干重存在良好的线性关系，线性系数（Ｒ２＝０．９９９ ８），该方法能快速、准确地分析泰乐菌素降解菌的生长量。

关键词：生长量；泰乐菌素降解菌；电导率

中图分类号：Ｑ９３－３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）16－3601-02

Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－Dｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ

ＸＩＥ Ｌｉ，ＳＵＮ Ｒｕｉ－ｚｈｕ，ＭＡ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｊｕｎ－ｌｉａｎ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００21， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｑｕｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｅｎｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｅｒｆｅｃｔ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２＝０．９９９ ８． Ｉｎ ａ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｒｏｗｔｈ ｑｕａｎｔｉｔｙ； ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ

细菌在生长繁殖过程中，可通过测定细菌的生长量，来了解细菌的各种生理生化状态。目前，细菌生长量的测定主要有４类方法：细胞数目的测量（直接显微计数法、平板活菌技术、载片培养技术、微孔过滤法、库尔特计数器、流动细胞光度法、表荧光滤过技术、荧光抗体技术、微型ＥＬＩＳＡ、电子显微镜）；细胞量的测量（干重法、比浊法、离心压缩细胞体积法）；细菌浓度的间接测量（通过测定核酸、蛋白质、多糖、脂质、ＡＴＰ等含量来估算菌浓度，或通过测量Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｐ等元素的含量间接计算菌浓度）；生物量在线检测（微热量计法、荧光法、电容／电导／阻抗法等）［１］。其中比浊法检测成本低、快速，而在线检测技术准确，可实时分析细菌生长过程中的生长量，因此具有较好的应用前景。该文以早期分离筛选的泰乐菌素降解菌——无丙二酸柠檬酸杆菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）为材料［２］，比较了活菌稀释计数法、比浊法和电导率法绘制该菌生长曲线的差异，为研究该菌的形态学特征、适应性及泰乐菌素降解机理提供其生长量参数。

１材料与方法

１．１菌株来源

泰乐菌素降解菌（无丙二酸柠檬酸杆菌，由课题组分离筛选得到并保藏）。

１．２培养基和培养条件

酵母浸出粉胨葡萄糖（ＹＰＤ）培养基：酵母提取物１ ｇ，蛋白胨２ ｇ，葡萄糖２ ｇ，水１００ ｍＬ。

培养条件：细胞干重为０．３ ｇ／ｍＬ，１０％接种量，３０ ℃，１２５ ｒ／ｍｉｎ条件下培养。

１．３仪器

ＴＧＬ－２０Ｍ型高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、ＤＨＳ１６－Ａ烘干称量法水分测定仪（上海精密科学仪器有限公司）、ＤＤＳ－１２Ａ型数字式电导率仪（杭州东星仪器设备厂）、ＪＹ９８－ＩＩＩＮ型超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司）、ＵＶ－１２００型紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）。

１．４方法

１．４．１ 干重法取泰乐菌素降解菌培养液１０ ｍＬ，于１０５ ℃烘干样品，测定细胞干重，每个样品测定３次。

１．４．２电导率法取培养４８ ｈ的泰乐菌素降解菌菌液，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃离心２ ｍｉｎ，用去离子水清洗沉淀２次，以去离子水配制成不同浓度的菌液，用烘干称量法测定细胞干重；采用超声法破碎降解菌的细胞（５００ Ｗ超声６次，３０ ｓ／次，２０ ｓ／间隔），超声后，取０～５．０ ｍＬ系列体积的菌液，以去离子水定容至５．０ ｍＬ。用ＤＤ－１２Ａ型电导率仪测定电导率值，每个样品测定３次。

１．４．３比浊法采用上述样品液，于５００ ｎｍ下测定菌液的ＯＤ５００ ｎｍ，每个样品测定３次。

１．４．4活菌稀释计数法［３］取０．１ ｍＬ菌液，以磷酸盐缓冲液为稀释液，按１０倍梯度稀释８个梯度，每个稀释度涂布ＹＰＤ平板，设３个平行，培养９６ ｈ后，选取１０～３００个菌落数的平板计数。

１．４．5生长曲线的测定取４８ ｈ培养后的泰乐菌素降解菌种子液，将种子液按１０％的接种量培养，分别在８～７２ ｈ中，间隔８ ｈ取样。用活菌计数法测量培养基中细菌浓度，同时以１２１ ℃，灭菌２０ ｍｉｎ的ＹＰＤ培养基为对照，采用比浊法测定菌液浓度，重复３次，计算平均值；分别在８～７２ ｈ间，每间隔４ ｈ取菌液１ ｍＬ，加入装有３０ ｍＬ去离子水的试管中，同上条件超声处理，取细胞破碎后的菌液５．０ ｍＬ，用ＤＤ－１２Ａ型电导率仪测定电导率值，每个样品测定３次，计算平均值。绘制泰乐菌素降解菌培养时间与Ｉｎ（ｃｆｕ／ｍＬ）以及ＯＤ５００ ｎｍ和电导率值的生长曲线。

２结果

２．１泰乐菌素降解菌的生长曲线

分别采用活菌稀释计数法、电导率法和比浊法对泰乐菌素降解菌的生长曲线进行测定，结果如图１，图２所示。活菌稀释计数法测定的降解菌生长曲线符合细菌生长的各个阶段：０～８ ｈ为降解菌生长的延迟期，８～２４ ｈ为对数生长期，２４～５６ ｈ为稳定期，５６～７２ ｈ为衰亡期。电导率法测定的生长曲线也有明显的延迟期、对数生长期和稳定期，且延迟期和对数生长期的时间范围和活菌稀释计数法相似，但此法所测到的稳定期为２４～７２ ｈ，无衰亡期。而分光光度法的生长曲线始终保持上升状态，无明显的延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。

２．２破碎细胞的电导率

早期预试验中，泰乐菌素降解菌用去离子水清洗和定容后，发现菌液的电导率会随放置时间延长而增大，初步推测菌体细胞会向外释放游离电解质。通过超声波破碎细菌细胞，让电解质迅速游离出菌体，测定放置不同时间的破碎细胞菌液电导率来验证上述推断。

在相同超声条件下破碎不同体积细菌细胞，在自然冷却不同时间后，用电导率仪测量菌液电导率，结果见图３。由图３可知，在不同时间内，２００ ｍＬ降解菌菌液的电导率变化幅度较大。这是因为不同体积中细菌细胞量不同，采用相同的超声破碎条件，细胞量越多，析出的电解质越多，进而导致２００ ｍＬ菌液电导率的变化幅度大于５０ ｍＬ菌液。

在不同超声次数的条件下，相同体积菌液的电导率随时间的变化结果如图４。由图４可知，超声次数对菌液电导率影响较大。６次超声处理菌液的电导率随放置时间的变化为＋０．０１ μＳ／ｃｍ；４次超声处理菌液的电导率随放置时间的变化为＋０．４３ μＳ／ｃｍ；２次超声处理菌液的电导率随放置时间的变化为＋０．３４ μＳ／ｃｍ，并且放置９０ ｍｉｎ后，２次和４次超声处理菌液的电导率仍未达到６次超声处理的水平。故该试验采用的条件为：取２００ ｍＬ菌液，５００ Ｗ超声６次，３０ ｓ／次，每次间隔２０ ｓ。在该条件下，泰乐菌素降解菌菌液的电导率值与泰乐菌素降解菌细胞干重存在良好的线性关系（图５）。

３小结与讨论

由于菌体细胞的性状特征和培养基组分影响，可采用电导率法来替代比浊法测定细菌的生长曲线和生长量。因为在菌体细胞含量较大时，在液体培养基中容易下沉，采用比浊法会存在一定误差，另外，培养基的成分也会干扰细菌细胞的渗透情况，进而影响菌液的折射率以及浑浊程度。而采用浊度法时，不超过０．６５的吸光度才与菌体间存在较好的线性关系，而采用电导率值分析细菌生物量则没有此类限制。由于细胞计数法、细胞干重和湿重法、活菌计数法（平板菌落计数、ＭＰＮ法、试剂纸法、膜过滤等）以及测定生理指标法（定氮和ＤＮＡ含量测定）操作繁琐且耗时耗能，因此，采用快速准确的电导率法，将有较好的应用前景。

电导率值之所以能够较为准确地反映降解菌的生长量，主要有两个原因：其一，细胞释放了无机盐离子，其二，细胞中不导电的生物大分子物质在细胞内的各种物质代谢过程中分解成了导电的小分子物质［４］，但采用电导率法时，其电信号会受到培养基成分、ｐＨ、气泡等因素干扰［５］。为此，笔者发现采用去离子水清洗并稀释菌液，可较好地减少干扰。综上所述，采用电导率法能够准确快速地测定泰乐菌素降解菌的生长量，该方法的建立将为筛选泰乐菌素药渣中的降解菌株提供较好的评价方法。

参考文献：

［１］ 沈萍，陈向东．微生物学［Ｍ］． 第二版．北京：高等教育出版社，２００６．１５１－１５４．

［２］ 刘力嘉，谢丽，张作义，等．泰乐菌素高效降解菌的筛选及降解特性研究［Ｊ］．农业环境科学学报，２０１１，３０（５）：１０２７－１０３０．

［３］ 任晓燕，剡根强，周霞．粪肠球菌生长曲线的测定［Ｊ］．兽医杂志，２００５，２４（６）：１０－１１．

［４］ ＳＶＥＮＳＳＯＮ Ｕ Ｋ． Ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Dａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，７７（１２）：３５１６－３５２３．

［５］ ＳＩＮＧＨ Ａ， ＫＵＨＡＤ Ｒ Ｃ， ＳＡＨＡＩ Ｚ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ［Ｊ］． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５１：４７－７０．