动物源性食品鸭血、猪血DNA提取及多重PCR鉴别研究

吕二盼，周 正，周 巍，李洋洋，张 薇，吴 涛，曾小盼，李 波，张 伟，*

（1.河北省食品质量监督检验研究院，河北石家庄 050091；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

动物源性食品鸭血、猪血DNA提取及多重PCR鉴别研究

吕二盼1，2，周 正1，周 巍1，李洋洋2，张 薇1，吴 涛1，曾小盼1，李 波1，张 伟2，*

（1.河北省食品质量监督检验研究院，河北石家庄 050091；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

目的：研究从鸭血、猪血中提取DNA的快速简便方法并建立多重PCR鉴别方法。方法：用KI提取法从固体块状鸭血、猪血中提取DNA，经PCR扩增检测提取效果。建立多重PCR方法鉴别动物源性食品中的鸭血、猪血成分，并对市售动物源性血制品进行检测。结果：这种方法提取到的DNA纯度较高，凝胶电泳条带整齐，背景清晰；PCR反应能扩增出目的条带。多重PCR能同时扩增出鸭和猪的条带。结论：这种改进的DNA抽提方法能获得高纯度DNA，比传统方法安全、简便、节省试剂，PCR扩增结果很好，应用多重PCR方法能同时检测出血样制品中的鸭、猪成分。

鸭血、猪血DNA，核酸提取，多重PCR检测

Abstract：Objective：Study on duck blood and pig blood aimed to find a quick and easy way to extract DNA and establish multiple PCR method for identification.Methods：The KI method was used for DNA extracting from the solid massive duck blood and pig blood and was detected by PCR amplification.A multiplex PCR method was established to identify the duck，pig blood ingredients in the food of animal original and carried on the examination to animal blood products from the market.Results：The gel electrophoresis stripes indicated that this DNA extraction method was of high purity，clear and neat.And the target bands could be amplified by PCR.Multiplex PCR simultaneously amplified duck and pig bands.Conclusion：The improved DNA extraction methods could obtain the DNA of high purity.It was safe，convenient and economical compared with the traditional method.PCR.Amplification result was good，the application of multiplex PCR method could also detect duck and pig ingredients in the blood product sample.

Key words：duck，pig blood DNA；nucleic acid extracting；multiplex PCR detect

近年来，随着疯牛病、羊瘙痒病、口蹄疫、禽流感等一些疾病在欧洲及世界各国的流行，以及一些动物源食品掺假造假现象的普遍产生，对食品、药品以及饲料产品进行动物源性成分鉴定，已经成为一个备受关注的问题[1-2]。尤其是现在时期，动物源性食品掺假、过分添加各种添加剂、使用非食用性原料和成分等各种食品安全问题不断出现，去年双汇瘦肉精事件、染色馒头事件、河南南阳毒韭菜事件等食品安全事件的频发越来越让老百姓心惊胆颤。近年来有不少关于动物全基因组DNA提取的研究和报道[3-4]，但以血样做材料的研究比较少，同时由于不同的材料和提取方法的差异，提取的基因组DNA的纯度和量也有所不同，如何选取合适的组织材料利用恰当的方法来提取高质量的基因组DNA，是一个值得探讨的问题[5]。鸭血因营养价值高、食用功效好而价格明显高于猪血价格，部分商家为了盈利可能会在鸭血中掺杂猪血甚至牛血、鸡血来销售。针对鸭血的加工过程及现实中存在的上述问题，本研究针对如何从鸭血、猪血中提取高质量DNA进行分析比较，对传统的方法进行了改进[6]，在省时、高效的同时减少对操作人员的身体危害。以DNA为基础的PCR技术被广泛用来鉴定食品中的动物源性成分[7-8]，高质量、高纯度及结构完整的基因组DNA的获得是开展该方面研究工作的前提，是保证各检验检疫机构顺利进行这项工作的必要条件。本实验分别采用鸭、猪特异性引物对从血样中提取的DNA进行PCR检测。在此基础上进一步研究在同一体系中加入猪和鸭的引物以及几种动物血样的混合模板建立多重PCR快速鉴别方法，之后随机抽取一定数量的市售血样制品（主要是血豆腐食品）进行实际样品的检测，来验证该方法的准确性和可操作性，为各监管部门和检疫机构提供实际指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鸭血、猪血 石家庄超市；氯仿、异戊醇、无水乙醇 优级纯；醋酸钠 分析纯，纯度99%，配制成3mol/L；KI分析纯，纯度98.5%，配制成6mol/L，天津市科密欧化学试剂有限公司；引物 生工生物工程（上海）有限公司合成；PCR体系预混液Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 宝生物工程（大连）有限公司，溶液组成：Taq酶1.25U/μL；dNTP Mixture 2×conc各0.4mmol/L；Taq Buffer 2×conc 3mmol/L Mg2+，色素Marker，比重增加物，稳定剂。

DYY-4C型电泳仪 配有DYCP-31系列DNA水平电泳槽和垂直电泳槽，北京市六一仪器厂；Universal Hood II凝胶成像仪 配有WHITE和UV灯，Quantity One图像分析处理系统，美国BIORAD公司；Mastercycler gradient PCR仪 配有96孔反应板和可调梯度设置，德国Eppendorf；TGL-16B台式高速离心机 配有12孔可调离心转子，上海安亭科学仪器厂。

1.2 引物

参照文献[9]合成扩增鸭源性成分的引物，参照文献[10]合成扩增猪源性成分的引物，引物序列及扩增片段长度见表1。

表1 引物序列及扩增片段长度Table 1 The primer sequence and amplification length

1.3 实验方法

1.3.1 KI法提取DNA 取0.4g血样于1.5mL EP管中，在液氮环境中捣碎；加双蒸水400μL溶解，摇匀20s；混匀后加6mol/L KI溶液400μL，摇匀20s，12000r/min离心12min；取上清，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1），即加即摇，混匀，12000r/min离心10min；取上清，加1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，室温沉淀15min，12000r/min离心10min；小心倒掉上清，吸水纸上拍干，用-20℃保存的75%乙醇洗涤（500μL或1mL），不振动，12000r/min离心10min；弃乙醇，干燥后，加TE溶液30μL溶解DNA[11]，制成的DNA溶液-20℃保存备用。

1.3.2 DNA质量及纯度检测 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取鸭血、猪血基因组总DNA片断大小及DNA的降解情况，以检测其完整性和质量。电泳完后凝胶成像分析。

提取的溶于TE的DNA样品经稀释后，以TE做空白对照在紫外分光光度计上测260nm和280nm的光吸收，根据OD260nm/OD280nm来估计DNA的纯度。根据公式计算DNA浓度或仪器计量显示浓度。

DNA浓度（μg/μL）=OD260nm×核酸稀释倍数×50/1000

1.3.3 引物特异性检测 利用鸭的引物，分别以鸭、鸡、牛、羊、猪的DNA为模板进行PCR扩增；用猪的引物，分别以鸭、鸡、牛、羊、猪的DNA为模板进行PCR扩增，以鉴定引物的特异性。

1.3.4 建立多重PCR方法鉴别掺假成分 双重PCR反应体系为：预混液25μL，鸭引物各2μL，猪引物各0.5μL（引物浓度为20μmol/L），鸭模板1μg，猪模板0.5μg，用ddH2O补足体系50μL。双重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。

之后将鸡血、兔血与鸭血、猪血以适当比例混合均匀后，提取几种动物的总DNA，然后用鸭、猪特异性引物进行多重PCR反应。多重PCR反应体系为：预混液25μL，鸭引物各2μL，猪引物各0.5μL（引物浓度为20μmol/L），混合模板2μg，用ddH2O补足体系50μL。多重PCR反应条件同双重PCR反应。检测结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳确定。

1.3.5 多重PCR灵敏度检测 将鸡血、兔血、鸭血、猪血等比例混合后用1.3.1方法提取总基因组DNA，模板DNA经10、100、200、1000、2000倍系列稀释后进行PCR扩增，以检测多重PCR方法的灵敏度[12]。

1.3.6 实际样品检测 在建立多重PCR的快速鉴别方法后，我们将研究对象扩展到实际样品，以检测用多重PCR方法能否成功扩增出市售血制品中所含的动物源性成分，来进一步验证方法的准确性和可行性。我们从超市和集贸市场上随机购买13种常见的血豆腐制品，用多重PCR方法进行了鸭源性成分和猪源性成分的检测，同时用新鲜鸭血、猪血DNA做阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 提取的DNA质量及纯度结果

常用的电泳缓冲液有TAE和TBE，TAE缓冲能力较低，后者有足够高的缓冲能力，因此更常用。此实验所用缓冲体系为TBE电泳液，在室温以5V/cm恒压电泳，所提取的鸭血、猪血DNA电泳结果见图1。由图1可知，此方法所获基因组DNA均呈现亮带，电泳条带清晰、片段的大小一致，整齐均匀，背景清晰。所提DNA所测OD260nm/OD280nm值在1.70～1.93，浓度为（0.1～2.0）μg/μL。分光光度分析DNA的OD260nm/OD280nm数据与提取过程中有机溶剂沉淀蛋白质的次数有关，反复沉淀的次数多了，DNA产品损失就大；沉淀的次数少了，蛋白质分离就不彻底。紫外分光光度计是采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置产生特定波长的光，光源透过测试样品时，分子中的某些基团吸收了紫外可见光，发生了电子能级跃迁而产生吸收光谱，反映了分子中基团的信息。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，都有吸收紫外光的特性。碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。通过紫外测得溶液的吸光度，计算样品的吸光度值，从而转化成样品的浓度，二者成正比。核酸的λm＝260nm，即在波长260nm处有最高吸收峰。DNA是脱氧核糖核苷酸的高聚物，双螺旋结构。RNA是核糖核苷酸聚合而形成的没有分支的单链，分子量比DNA小；DNA为线状分子，RNA为线团。但紫外分光光度法不能区分DNA和RNA，OD260nm/OD280nm只能用来鉴定核酸的纯度。纯DNA的OD260nm/OD280nm比值为1.8，纯RNA为2.0。由于蛋白质中存在着含有共轭双键的芳香氨基酸（酪氨酸和色氨酸），因此也能吸收紫外光。其吸收高峰在280nm波长处，可作为蛋白质定量测定的依据，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，比值可进行核酸样品纯度评估。当OD260nm/OD280nm大于等于2.0，说明残存的RNA较多；当OD260nm/OD280nm小于1.8，说明提的DNA不纯，存在蛋白质（芳香族）或酚等杂质；当OD260nm/OD280nm等于1.8时，说明样品中蛋白质含量低，DNA纯度高。由测得结果可知，提取的DNA无RNA和蛋白质或酚的污染，且没有在提取过程中发生降解。从血样中提取的总DNA无论是浓度还是纯度都较高，完整性很好，达到了PCR反应的要求，能满足分子生物学实验的需要。

图1 DNA提取结果Fig.1 The DNA extraction results of blood

2.2 引物特异性结果

利用鸭的引物，分别以鸭、鸡、牛、羊、猪的DNA为模板进行PCR扩增；用猪的引物，分别以鸭、鸡、牛、羊、猪的DNA为模板进行PCR扩增，特异性结果见图2～图3。图2只有鸭血DNA的模板能扩增出226bp目的条带；图3只有猪血DNA的模板能扩增出149bp目的条带，其他模板都是阴性。

图2 鸭引物的特异性结果Fig.2 The specificity result of duck primer

图3 猪引物的特异性结果Fig.3 The specificity result of pig primer

2.3 鸭血掺假多重PCR结果

经过多次实验对比优化引物和模板浓度，得出上述1.3.4的加入量扩增效果最好，原因是引物之间存在竞争，猪引物的特异性较鸭引物更强。在一个体系中同时加入鸭和猪的引物，加入两种血样提取的混合模板，可同时扩增出鸭源性成分和猪源性成分，两个目的条带清晰，位置与阳性对照条带也一致，由此我们成功建立了鸭血中掺杂猪成分的鉴别方法，此方法快速、简便，一次反应即可同时鉴别两种动物源性成分，可为各检验机构提供方法指导。双重PCR结果见图4。

图4 双重PCR结果Fig.4 Double PCR results

将鸡血、兔血分别与鸭血、猪血等比例混合均匀后，用提取的总DNA进行多重PCR反应，同时做阳性对照。由图5结果可见，只能扩增出鸭和猪的特异性条带，没有鸡和兔的非目的条带，由此可以检测未知的血样中是否含有鸭和猪的成分。

图5 多重PCR结果Fig.5 Multiple PCR results

2.4 多重PCR灵敏度结果

用KI法提取鸡血、兔血、鸭血、猪血混合样品的DNA，在一个反应体系中同时加入鸭和猪的引物，加入四种动物血不同稀释度的混合模板，经PCR扩增后电泳显示，随着模板浓度的降低，两个目的条带的亮度逐渐减弱，如图6所示，当稀释1000倍时，条带仍很明显；当稀释2000倍时，猪的条带很暗，但仍可看出，鸭的成分未扩增出来，即稀释至原DNA提取液的0.05%时，才不能检测出鸭成分，此方法的检测灵敏度为0.1%。多重PCR对猪血的灵敏度较鸭血更高，与实验中单一PCR灵敏度结果相符合，可能是引物的原因。

图6 多重PCR灵敏度结果Fig.6 Sensitivity results of multiple PCR

2.5 实际样品检测结果

随机抽取的13个样品中，10个都检测出鸭源性成分，但有的也掺杂有猪血，3个样品鸭成分为阴性，有的是猪血做的假冒产品，有的可能是猪血外的其他动物血制成。3个样品同时检测出鸭和猪两种成分。结果见表2。证明此方法能检测血豆腐制品中的鸭源性成分和猪源性成分能进行假冒伪劣产品的鉴别，可进行推广应用。

表2 实际样品检测结果Table 2 Results of Actual samples

3 结论

基因组DNA的提取过程，研究中对经典酚-氯仿抽提法进行了改进。对于样品的预处理，采用液氮进行冷冻研磨，防止了因研磨过程中发热而导致的DNA降解和断裂，从而保证了DNA的完整性，且节省时间。KI在高温不稳定，而在此实验中没有水浴加热过程，都是在室温操作（条件允许可用可调温度离心机4℃离心），且使用的是双蒸水，不用担心水中含有Cl-等而导致的碘被氧化问题。DNA沉淀加NaAc等盐可中和核酸负电荷，在酸性环境中促进核酸疏水复性，加无水乙醇可以使DNA沉淀完全，添加的量必须注意，NaAc控制在所吸取上清的1/12～1/10，无水乙醇要加2～3倍体积。本法不用水浴，所用试剂少，离心次数少，简便、快速，不需特殊设备；所获得的DNA无RNA、蛋白质等污染；减少了各种有害因素对DNA的破坏，具有完整性好、纯度高和稳定性好等特点；可以满足PCR、RFLP酶切、分子杂交等各种分子生物学实验的需要。综上所述，是切实可行的方法，对大量固体块状血样制品的提取更为实用。

鉴别食品中的动物源性成分及各种食品的掺杂掺假，一直是各检验机构工作的重点，用分子生物学的检测方法比其他方法更准确、快速。本研究用PCR方法检测血豆腐类制品准确率高，耗时短，从DNA提取到扩增所需检测的动物成分，再电泳出结果，整个操作过程最多仅需3h，而且可一次同时对几十个样品进行检测。建立的多重PCR方法更能显示此方法的优点，可一次反应同时鉴别两种成分，在鉴定真伪的同时还能具体测出鸭血豆腐是否掺杂有猪血成分。有的伪劣鸭血制品是用猪血以外的其他动物血制成，可能是鸡血或牛血、兔血等，下一步我们会继续研究建立鸭、猪、鸡、牛、兔等的多重PCR鉴别方法来彻底解决这一难题，能准确鉴别鸭血制品中的其他多种动物源性成分，可为质检部门推广应用，作为实验室的常规检测手段。

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DNA extraction and multiple PCR distinction research of animal food duck blood and pig blood

LV Er-pan1，2，ZHOU Zheng1，ZHOU Wei1，LI Yang-yang2，ZHANG Wei1，WU Tao1，ZENG Xiao-pan1，LI Bo1，ZHANG Wei2，*
（1.Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research of Hebei，Shijiazhuang 050091，China；2.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0228-05

2012－02－07 *通讯联系人

吕二盼（1986-），女，硕士，研究方向：食品中有害微生物检测与控制。

河北省质量技术监督局重点项目（100102）。