柴胡皂苷-d 对大鼠肝癌细胞H4-ⅡE 细胞内Ca2+的影响研究

秦 勇 陈念平 叶冠雄 徐胜前 吴成军 王 世 潘德标

胆汁酸可通过诱导内质网(ER)中Ca2+的释放和(或)钙内流，改变细胞内钙离子浓度(［Ca2+］cyt)，来加强或抑制胆汁沿着胆道系统进行排泄，调节肝细胞一系列生理功能［1～3］。我国中药柴胡在临床应用中发挥不同的作用，柴胡皂苷是柴胡的主要化学成分，Yang等研究发现10μmol/L柴胡皂苷(I)能诱导大鼠胰腺腺泡细胞内钙库中Ca2+释放，增加细胞内Ca2+浓度，随后又出现胞外Ca2+内流，再次增加胞内Ca2+浓度［4～6］。而在随后的研究中证实，柴胡皂苷(I)通过与大鼠胰腺腺泡细胞膜受体的相互作用转导刺激信号，使［Ca2+］i先后两次达到峰值，从而持续加强柴胡皂苷(I)的促酶分泌功能。日本学者Kodama等［7］对C6型大鼠神经胶质瘤细胞的研究中发现10～100μmol/L柴胡皂苷－d可诱导细胞内钙库中Ca2+释放，使细胞内Ca2+浓度升高。综合上述学者的研究，柴胡皂苷－d可调控细胞内Ca2+浓度的变化，但能否诱导肝细胞系内Ca2+浓度的变化在国内少见报道，本实验在细胞水平上探讨SS－D对H4－ⅡE细胞内Ca2+浓度变化影响作用。

资料与方法

1．细胞株:大鼠肝癌细胞株H4－ⅡE购自上海拜力生物科技有限公司。

2．试剂和仪器:DMEM培养基(广州威佳公司)，石胆酸、熊脱氧胆酸(Sigma公司)，柴胡皂苷－d(南昌贝塔公司)，Fluo－3/AM荧光探针(香港先进技术公司)。

3．细胞培养:大鼠肝癌细胞株H4－ⅡE接种于含10%胎牛血清、100U/L青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养，每1～2天换液传代培养。传代时将原培养液吸出，加入0．25%胰蛋白酶溶液消化45s后，加入5ml左右的新培养液终止消化，然后用培养液吹打制成细胞悬液后传代或接种。

4．实验分组:第一大组:处理组为柴胡皂苷－d样品液加入培养液中，终浓度分别为处理组1(30μmol/L)、处理组2(50μmol/L)、处理组 3(70μmol/L)、处理组 4(100μmol/L)，同时每个处理组都加入终浓度为50μmol/L石胆酸(LCA);空白对照组:加入与处理组相同体积完全培养液(大鼠肝癌细胞H4－ⅡE);阴性对照组:终浓度为50μmol/L LCA加入与处理组相同体积培养液中;阳性对照组:终浓度为300μmol/L熊脱氧胆酸(UDCA)与终浓度为50μmol/L LCA同时加入与处理组相同体积培养液中。第二大组又分别设立空白对照组、终浓度为50μmol/L的LCA为阴性对照组、300μmol/L的UDCA为阳性对照组及50μmol/L的SS－D为处理组。

5．噻唑蓝(MTT)比色实验:取对数生长期生长良好的H4－ⅡE肝癌细胞以6×103/孔的密度接种于96孔培养板，每组设5个平行孔，培养箱中培养12h后(待完全贴壁)，换含有不同浓度的柴胡皂苷－d及对照组的H4－ⅡE肝癌细胞培养液，继续培养12h后，后进行MTT染色分析

6．荧光指示剂Fluo－3/AM结合流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度:①将浓度为5×105个/毫升的H4－ⅡE肝癌细胞接种于培养基中，培养24h后换液，第一大组及第二大组各实验组同时作用细胞12h后，无Ca2+的D－Hank's离心洗涤1000r/min×5min×3次，弃上清液，收集细胞(2～3)×106个细胞;②第一大组避光加入1ml终浓度为2．4mmol/L的Ca2+及5μmol/L荧光染料Fluo－3/AM孵育缓冲液悬浮细胞;37℃、5%CO2的培养箱中避光孵lh;③第二大组避光先加入lm l无Ca2+、pH值为8．8、终浓度为20mmol/L的乙二醇双四乙酸(EGTA)及5μmol/L荧光染料Fluo－3/AM孵育缓冲液悬浮细胞;37℃、5%CO2的培养箱中避光孵育1h。选用各实验分组作用于大鼠肝癌细胞株H4－ⅡE12h后，按照试剂盒上的说明书结合流式细胞仪检测H4－ⅡE细胞内Ca2+浓度的变化。

结 果

1．噻唑蓝(MTT)比色实验选择药物实验浓度:不同浓度的SS－D处理H4－ⅡE肝癌细胞12h后，SS－D对肝癌细胞的抑制作用不大，最大抑制率不超过11．12%;说明10～100μmol/L SS－D 对细胞的生长无明显影响(表1)。SS－D不同浓度时细胞的存活率见表1，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即细胞存活率在90%以上的浓度。

表1 柴胡皂苷-d组对H4-ⅡE肝癌细胞活性的影响(±+s)

表1 柴胡皂苷-d组对H4-ⅡE肝癌细胞活性的影响(±+s)

与对照组比较，★P＜0．05;与120μmol/L柴胡皂苷 －d组比较，▲P ＜0．05

组别 浓度(μmol/L) OD值 存活率(%)88．88 0．8208 ±0．0517柴胡皂苷 －d组 10 0．7810 ±0．0323▲★ 94．95 30 0．7730 ±0．0296▲★ 93．94 50 0．7676 ±0．0229▲★ 93．25 70 0．7610 ±0．0204▲★ 92．92 100 0．7622 ±0．0344▲★ 92．57 120 0．7702 ±0．0234★对照组

2．荧光指示剂Fluo－3/AM测定细胞内钙离子浓度:分析结果以1万个细胞平均荧光强度 (mean fluorescence intensity，MFI)表示细胞内钙离子的相对含量，结果显示第一大组中阴性对照组处理H4－ⅡE细胞12h后可引起细胞内Ca2+的MFI升高，阳性对照组可使细胞内Ca2+的MFI大幅度升高，两组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。处理组也可使细胞内钙离子的MFI不同程度升高，并且与SS－D呈浓度依赖性，与阴性对照组比较有差异(P＜0．05);处理组1、处理组3、处理组4与阳性对照组比较有差异(P＜0．05)，并且与SS－D呈浓度依赖性。第二大组中阴性、阳性及处理组都能使细胞内Ca2+的MFI增加，说明SS－D、LCA及UDCA都能诱导钙库中钙离子释放到胞质中。

3．流式细胞仪图观察各实验组Ca2+的变化情况:图1 中 A、B、D、E、F、G 各波峰代表进入区域的荧光数目，横线代表荧光强度;A组未见进入荧光强度区域内的波峰，G及C组也可见不同程度进入荧光强度区域内的波峰，而随着处理组浓度的增加，进入横线区域的波峰也增多，说明荧光强度及量呈不同程度

图1 石胆酸、熊脱氧胆酸、柴胡皂苷-d对H4-ⅡE细胞内钙离子浓度的影响

讨 论

钙离子是细胞内的主要第二信使，参与调控许多细胞和组织的生理活动，近期研究胆汁酸对大鼠肝癌细胞H4－ⅡE和原代正常的鼠肝细胞的作用，发现UDCA及其他的利胆胆汁酸，能诱导内质网钙库中Ca2+释放，激活 Ca2+内流［3，8］。而预培养 12h 的 LCA及其他淤胆胆汁酸也可诱导内质网钙库中Ca2+释放，但抑制Ca2+内流，利胆胆汁酸牛磺脱氧胆酸(TDCA)与淤胆胆汁酸LCA同时行细胞培养12h后，细胞内Ca2+浓度明显升高，这提示TDCA能抵消预培养12h的LCA对钙池操作性钙通道(SOC)的抑制作用，说明利胆胆汁酸能中和淤胆胆汁酸对细胞的毒害作用［3］。柴胡皂苷－d是柴胡化学成分中最具有活性的成分，能否诱导肝细胞系内Ca2+的变化，在国内研究甚少［4］。

本实验通过30～100μmol/L柴胡皂苷－d(SSD)加50μmol/L LCA作为处理组、UDCA加LCA作为阳性对照组及LCA作为阴性对照组同时孵育大鼠肝癌细胞 H4－ⅡE 12h后，结果显示 LCA可引起［Ca2+］cyt升高，UDCA可使其大幅度升高，不同浓度的SS－D也可使其不同程度升高，并且与SS－D呈浓度依赖性，而50μmol/L的LCA、300μmol/L的UCDA及50μmol/L的SS－D作用于大鼠肝癌细胞H4－ⅡE 12h后都能使［Ca2+］cyt增加，说明SS－D与利胆胆汁酸具有相同作用，而有研究在胆汁淤积症鼠模型中证实，利胆胆汁酸能预防胆管细胞受损，维持其正常的功能活动［9］。又有研究表明，肝细胞内胞质中游离Ca2+浓度的升高是由于胞外Ca2+内流和胞内钙库中Ca2+的释放所致，而这又是胆管收缩，促使胆汁酸沿着胆小管移动的必需的部分机制。而SSD对乙醇损伤大鼠肝细胞研究表明，SS－d能增强机体抗氧化防御能力［10］。抑制自由基的产生，促进肝细胞增殖，防止肝细胞损伤和坏死。这更进一步说明SS－D可能通过影响细胞内Ca2+变化来刺激胆汁流量，在分子水平上减少氧自由基的产生，从而起到保护肝细胞内能量代谢、减轻肝脏损伤的作用。

综上所述，结合本次实验，是否可推测SS－D可能作为一种“天然的利胆药”，在胆汁淤积症中或肝内外胆道梗阻解除的情况下，通过诱导细胞内钙库中Ca2+的释放来提高胞质中钙离子浓度，加强胆汁排泄。但SS－D在调控细胞内Ca2+浓度的变化是否与膜上的钙信号通路有关，值得更进一步研究。

1 Lau BW，Colella M，RuderWC，etal．Deoxycholic acid activates protein kinase C and phospholipase C via increased Ca2+entry at plasma membrane［J］．Gastroenterology，2005，128(3):695 －707

2 Gerasimenko JV，Flowerdew SE，Voronina SG，et al．Bile acids induce Ca2+release from both the endoplasmic reticulum and acidic intracellular calcium stores through activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors［J］．JBiol Chem，2006，281:40154 － 40163

3 Aromataris EC，Castro J，Rychkov G，et al．Storeoperated Ca2+channels and stromal interaction molecule 1(STIM1)are targets for the actions of bile acids on liver cells［J］．Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2008，1783(5):874 －885

4 史群云，高丽丽．柴胡的研究现状［J］．医护论坛，2009，6(3):158－159

5 YangWX，Yu Y，ZhangWZ，et al．Inhibitory role of GDP on saikosaponin(I)stimulated enzymes secretion and rising of［Ca2+］i in rat pancreatic acini［J］．Acta Pharmacol Sin，2001，22(7):669 － 672

6 Yu Y，Yang WX，Wang H，et al．Characteristics and mechanism of enzyme secretion and increase in［Ca2+］i in Saikosaponin(I)stimulated rat pancreatic acinar cells［J］．World JGastroenterol，2002，8(3):524－527

7 Kodama Y，Xiaochuan L，Tsuchiya C．Dual effect of saikogenin D:in vitro inhibition of prostaglandin E2 production and elevation of intracellular free Ca2+concentration in C6 rat glioma cells［J］．Planta Med，2003，69(8):765 －767

8 Joel C，Edoardo C，Grigori Y，et al．A small component of the endoplasmic reticulum is required for store－operated Ca2+channel activation in liver cells:evidence from studies using TRPV1 and tauro－deoxycholic acid［J］．Biochem J．2009，418:553 －566

9 Marco M，Heather F，Antonio B，et al．Ca2+－ dependent cytoprotective effects of ursodeoxycholic and tauroursodeoxycholic acid on the biliary epithelium in a ratmodel of cholestasis and loss of bile ducts［J］．American Journal of Pathology，2006，168，(2):398 －409

10 李素婷，周晓慧，杨鹤梅，等．柴胡皂苷－d对乙醇损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用［J］．承德医学院院报，2007，24(4):352－354