弓形虫表面抗原P22的重组体构建及临床应用研究

吴丽霞 赵玉红 孙超 郭晶 陈咏君 张莉 杨丽荣 李新新

(1.沈阳医学院沈洲医院，辽宁沈阳 110002，2.沈阳市妇女儿童保健中心遗传室；辽宁沈阳 110032，3.沈阳市大东区妇幼保健所，辽宁沈阳 110042，4.沈阳医学院，辽宁沈阳 110034)

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫引起的一种原虫病，是一种人畜共患病，宿主的种类十分广泛，人和动物的感染率都很高。据国外报道，人群的平均感染率为25%～50%，有人推算全世界至少有5亿人感染弓形虫。

表面抗原P22与其侵入宿主细胞有密切关系，弓形虫感染者血清中的IgG和IgM抗体均可识别P22表面抗原，因此P22可以作为弓形虫感染的诊断抗原，并具有良好的抗原性与免疫原性［1，2］。目前弓形虫感染诊断方法主要有免疫学检测、直接镜检、病原体分离和聚合酶链反应(PCR)检测等［3-5］。免疫学方法由于操作简便快捷适于临床使用。本研究通过PCR扩增P22基因片段，测序后连接到载体pGEX-4T-1进行表达，对表达的重组蛋白进行表达与纯化，为进一步应用该基因进行弓形虫病诊断的研究做好准备。

1 实验材料

细菌菌株及载体：pGEX-4T-1质粒由本实验室保存，E.coli BL21购自华美生物技术有限公司

酶及其他试剂：DNA polymerase，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI和XhoI均为 TaKaRa公司产品；蛋白质分子质量标准，sepharose 4B纯化柱购自华美生物技术有限公司。

ELISA试剂、酶标板。

2 实验方法

2.1 PCR引物 由上海英俊生物技术有限责任公司合成，在正向引物F1和反向引物R1分别引物BamHI和XhoI酶切位点。

2.2 目的片段的扩增 首先以F2为模板，F1和R2分别为正反向引物进行PCR扩增，反应条件为变性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，复性72℃ 10秒，进行25个循环，再72℃延伸1分钟。经1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测分析，并回收纯化PCR产物，命名为F1R2。以此类推，以同样的方法扩增回收产物 F3R4、F5R6、F7R8。

分别以F1和R4为正反向引物，连接F1R2和F3R4，反应条件为变性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，复性72℃ 15秒，进行25个循环，再72℃延伸1分钟。经1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测分析，并回收纯化PCR产物，命名为F1R4。以同样的方法扩增回收产物F5R8。

分别以F1和R8为正反向引物，连接F1R4和F5R8，反应条件为变性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，复性72℃ 30秒，进行25个循环，再72℃延伸1分钟。经1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测分析，并回收纯化PCR产物，命名为F1R8。

2.3 pGEX-4T-1-P22重组质粒的构建与鉴定 纯化的PCR产物F1R8经BamHI和XhoI酶切，并与经过同样处理的pGEX-4T-1原核表达载体连接，转化到大肠杆菌TOP10中，抽取质粒DNA，进行酶切鉴定，并转化到大肠杆菌BL21中。

2.4 pGEX-4T-1-P22融合蛋白的诱导表达 将含pGEX-4T-1-P22重组质粒的BL21菌液以1∶100的比例加入到LB培养液中，37℃振荡培养2小时后加入IPTG至终浓度为1 mmol/l，37℃诱导3小时后离心收集菌体，重悬于2x样品缓冲液中，100℃煮沸，进行SDS-PAGE电泳分析。

2.5 表达蛋白的纯化 取诱导后的菌体培养液离心收集菌体，经超声破碎后利用sepharose 4B进行纯化柱。具体操作按照说明书进行。

2.6 重组蛋白的抗原性分析 将重组的菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，切胶进行蛋白质电转移，将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上，用自制的免抗弓形虫多抗与膜上的蛋白进行抗原-抗体反应，用酶标二抗进行进行检测，TMB显色，至目的条带显色清晰时终止反应。

2.7 捕获ELISA方法的建立 以方阵滴定法分别确定P22抗原的最佳使用浓度。用羊抗人IgMμ链包被酶标板，封闭，加入待检血清和HRP-P22并置于37℃反应，PBS-T洗板，加显色液37℃显色，最后用 2 mmol/L H2SO4溶液终止反应，测定吸光度值。

3 结果

3.1 PCR扩增P22片段 用设计的12条引物扩增出了438 bp大小的DNA片段，与预期分子量大小相符(见图1)。

图1 P22基因片段扩增结果

3.2 重组体的构建与鉴定 将以BamHI和XhoI双酶切的438bp产物与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌TOP10中，进行重组克隆的筛选，提取质粒，进行双酶切鉴定，分别在438bp和5kb处出现条带(见图2)。

图2 pGEX-4T-1-P22重组质粒经BamHI和XhoI内切酶酶切鉴定结果M1：DNA Marker；1：pGEX-4T-1-P22双酶切产物；2：pGEX-4T-1双酶切产物

3.3 重组蛋白的表达鉴定及纯化 将重组质粒pGEX-4T-1-P22的菌液进行IPTG诱导后，经SDSPAGE电泳检测，在分子量43KD处出现一条新的蛋白带，其大小与推测的pGEX-4T-1-P22融合蛋白分子量一致。(见图3)。

图3 pGEX-4T-1-P22表达产物的SDS-PAGE分析

3.5 Western blot鉴定 诱导表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳，电转移到NC膜上，进行 Western blot分析(图4)。结果在相应位置出现特异性抗原-抗体反应条带，表明表达蛋白与其抗体有良好的反应原性。

3.6 捕获ELISA方法的建立

3.6.1 最佳工作条件的确定 经过试验最后确定P22抗原浓度为1.0 μg/ml。用羊抗人IgMμ链包被酶标板，4℃过夜；次日用封闭液封闭，室温放置3小时；每孔加入20 μL待检血清和100 μL HRP-P22(高碘酸钠还原法制备)，37℃反应60分钟；PBS-T洗板5次，每孔加底物A、底物B各50 μL，37℃显色15分钟，每孔加50 μL 2 mmol/L H2SO4溶液终止反应，测定吸光度值。

图4 纯化产物的Western blot分析

3.6.2 与意大利SORIN试剂盒的比较 应用捕获法检测弓形虫IgM抗体与意大利SORIN试剂盒对450份临床血清进行检测。结果如表1所示：

表1 与意大利SORIN的弓形虫病毒抗体IgM检测试剂盒(化学发光法)进行对比

根据结果得出本院试剂盒阳性符合率为92.16%，阴性符合率为88.06%，总的符合率为88.89%。

4 讨论

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是猫科动物的肠道球虫，该虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染。引起人畜共患的弓形虫病大多为隐性感染，但在宿主免疫功能低下时，可造成严重后果。孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘垂直传播给胎儿，造成流产、早产、畸胎或死胎，尤以早孕期感染后畸胎发生率高，是造成我国新生儿出生缺陷的一个重要原因。国家人口计生委已连续3年开展了出生缺陷一级防御工作，为提高我国人口素质，降低我国新生儿畸形儿的发病率，对孕妇进行弓形虫产前筛查尤为必要。

目前，弓形虫感染诊断方法主要有病原学、免疫学、分子生物学等，其中免疫学方法由于操作简便快捷等优点而被广泛应用。用于弓形虫诊断的抗原有弓形虫膜表面抗原、重组棒状体蛋白、弓形虫微线体蛋白等。根据使用抗原的不同，检测结果的意义也不同。

弓形虫速殖子表面抗原SAG2(P22)蛋白是刚地弓形虫主要表面抗原之一，Grimwood等［6］的研究表明，SAG2蛋白不仅在介导弓形虫速殖子的入侵过程中起很重要的作用，而且还可以增强免疫动物抵抗感染的能力，具有免疫保护的作用，所以SAG2抗原很早就受到国内外学者的重视。

SAG2可以作为免疫诊断及基因工程疫苗的候选抗原，由于纯化天然SAG2蛋白制备工艺复杂且得量较少，利用基因工程的方法是大量制备高纯度的SAG2抗原的可行之路。

Tomavo等［7］研究发现，SAG2的N端前导信号肽与C端锚锭表膜的氨基酸序列具有高度疏水性。国外有采用PET系列表达载体的，重组蛋白的表达量为16%［8］，为了使SAG2蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达，本研究去除序列中N端的疏水性信号肽及C端的疏水性氨基酸。选择从N-末端第27位到第172位的1467个氨基酸，根据碱基序列并优化稀少密码子共合成12条引物，通过PCR扩增所需的基因片段，构建的重组质粒pGEX-4T-1-P22经充分诱导后，以融合蛋白的形式在E.coli内表达，通过优化表达条件使融合蛋白在上清中高效表达［9］，且P22融合蛋白具有GST标签便于纯化，为后续工作提供了便利条件。免疫印迹试验显示该重组蛋白能够被感染弓形虫的兔血清识别，表明其与天然蛋白的免疫原性一致。

本研究通过基因重组的方法制备P22抗原，能够避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，为弓形虫感染的检测提供更为特异、准确的原料。IgM抗体是体液免疫中最早出现的抗体，通过该抗原建立的试剂盒可以用于孕妇的急性弓形虫感染检测，对于产前筛查有着非常重要的意义。

［1]雷明军，吴少庭，戴五星，等.弓形虫RH株膜表面抗原SAG2全长基因的高效表达与抗原性分析［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2004，8(4)：231-234.

［2]Lunden A，Parmle Y SF， Bengtsson KL， et al.Use of areeombinant antigen， SAG2， expressed as a glutathione-S-transferasefusion protein to immunize mice against Toxoplasma gondii［J］.Parasitol Res，1997，83：6-9.

［3]Li S，Galvan G，Araujo FG，et al.Serodiagnosis of recently acquired Toxoplasma gondii infection using an enzyme-linked immunosorbent assay with a combination of recombinant antigens［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7(5)：781-787.

［4]Burg JL，Perelman D，Kasper LH，et al.Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii［J］.J Immunol，1988，141(10)：3584-3591.

［5]杨永刚，曹利民，朱荫昌.弓形虫病免疫诊断用重组抗原及检测方法研究进展［J］.国际医学寄生虫病杂志，2010，37(4)，248-253.

［6]Grimwood J，Smith JE.Toxoplasma gondii：the role of parasite surface and secreted proteins in host cell invasion［J］.Int J Parasitol，1996，26(2)：169-173.

［7]Toma O S，Maxtinage A，Dubremetz JF.Phosphorylation of Toxoplasma gondii major surface antigens［J］.Parasitol Res，1992，78(7)：541-544.

［8]Prince JB，Auer KL，Huskinson J，et al.Clonig，expression，and cDNA sequence of surface antigen P22 from Toxoplasma gondii［J］.MolBiochaim Parasito，1990，43(1)：97-106.

［9]聂福旭，蒋蔚，王权，等.弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析［J］.生物技术通报，2010，4：174-178.